203583. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bakteriális fertőzések ellen védő emberi monoklonális antitest-készítmények és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására

HU 203583B

festése poliakrilamid géleken: Módosított eljárás fokozott egységes érzékenységgel/, anal. Biochem.

117,307-310/1981/), és megvizsgáljuk antitest aktivitásra is ELISA-val a fentebb leírtak szerint.

Az egyes bakteriális kihívások vizsgálatához 5 nőstény, tenyésztett Swiss-Webster egereket (20- 22 g súllyal) három csoportba osztunk, minden csoport tíz egeret tartalmaz. A reprezentatív kísérletet a következőképpen hajtjuk végre:

25

Csoport

Baktériumok

Antitest

A

E.coli 08

7D7

B

E.coli 08

6F11

C

S.marcescens014

7D7

Mindegyik csoportot, amely antitestet kapott, intravénásán injektáljuk 200 pl steril PBS-sel, 20 amely 25 pg tisztított antitestet tartalmaz. Két órával később az összes állatot intraperitoneálisan 300 pl élő baktérium kihívásának vetjük alá, a tenyészet 3 LD5 Oaennyiségben tartalmazza a megfelelő baktériumtörzset. A baktériumszuszpenziót logaritmikus növekedési fázisban levő folyékony tenyészetből készítjük olyan módon, hogy a tenyészetből a baktériumot centrifugáljuk, kétszer mossuk PBS-ben és újra szuszpendáljuk megfelelő koncentrációra PBS-sel. Az állatokat öt napos időtartamon át figyeljük. A kihívás után 24-28 óra múlva már a B csoportban levő (nem megfelelő antitest) és a C csoportban levő (nem megfelelő organizmus) összes állat elpusztul. Ezzel ellentétben azok az állatok, amelyek 7D7 antitestet kaptak (A csoport) élnek és tünetmentesek.

Ezt az állatokat gyógyító modellt alkalmazzuk, hogy a 7D7 antitest gyógyászati hatását bemutassuk a fentebb említett három nemzetséghez tartozó organizmusok bakteriális kihívása ellen. Az adatok összefoglalását a 2. Táblázatban mutatjuk be.

26

10

2. Táblázat

Kihívást jelentő baktérium

Antitest

Túlélú/kihívás

%-os túlélés

E. coli 08

7D7

10/10

100

E. coli 08 ,

6Flla

0/10

0

S. marcescens 014°

0/10

0

6F11 antitest a Pseudomonsa aeruginosa Fisher-féle 2. immuntípusára fajlagos, és itt negatív kon toll antitestkéntszolgál.

S. marcescens 014 nem reaktív a 7D7 antitesttel, és nem fajlagos kontroll organizmusként szolgál

2a. Táblázat-Antitest

0

%-os túlélés0 ^ napok

1 2 3

4

40

6F11

12

2 2 1

1

7D7

12

10 6 4

4

45

cXz LD50 és a védőhatás vizsgálatát olyan egerekkel hajtjuk végre, amelyek ciklofoszfamid-injekcióval neutropéniássá vannak téve a következő 50 módon: 0. nap - 150 mg/kg; 2. nap - 50 mg/kg. A 4. napon az egerek antitestet és baktériumokat kapnak a leírtak szerint

Ezek az adatok azt demonstrálják, hogy d 7D7 humán monoklonális antitest képes egereket meg- 55 védeni a három különböző gram-negatív baktérium-fajhoz tartozó baktériumokkal végrehajtott halálos kihívástól. Mivel a 7D7 az LPS-en jelen levő szénhidrát epitópokkal reaktív, viszont a K. pneumoniae-n levő LPS molekulák kevésbé hozzáférhe- 60 tőek (OrskovI. és OrskovF. „Serotyping of Klebsiella” /AKlebsiella szerotipizálása/, a Methods in Microbiology című kiadvány 14. kötetében /szerkesztő:

Bergan T., kiadó: Academic Press, Orlando, Florida/

/1984/143-146), a 7D7 antitest által nyújtott véde- 65

lem a K. pneumoniae fertőzések ellen nem nyflvánvaló (adatokat nem mutatunk be). A 7D7 nemzetségek között kereszt-reaktív humán monoklonális antitest mindazonáltal képes védelmet nyújtani 25 pg tisztított antitesttel az E. coli és E. aerogenes gramnegatív baktériumfajokhoz tartozó organizmusokból eredő fertőzések ellen.

II. példa

A n. példa módszereket nyújt olyan humán monoklonális antitestek termeléséhez és kiválasztásához, amelyek nemzetségek közti kereszt-reaktivitással bírnak Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae és Enterobacter aerogenes fajok tagjai ellen. Ezen kívül ez a példa demonstrálja az említett antitest in vitro opszonikus aktivitását homológ S. marcescens, K. pneumoniae és E. aerogenes szerotípusok ellen. Az I. példa eljárását (lényegében úgy, ahogy ezt az A-G részben leírtuk) ismételjük meg, hogy olyan humán monoklonális antitestet állítsunk elő, amely kereszt-protektív az itt leírt baktériumok által okozott fertőzések ellen, azzal a kivétellel, hogy speciális módosításokat szükséges végezni a jelen példában leírt antitest jellemzéséhez és méréséhez. A következők a változások a mérési eljárásokban és az itt leírt monoklonális antitesttel kapott eredményekben.

1. Hat transzformációból származó tenyészet

14