203583. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bakteriális fertőzések ellen védő emberi monoklonális antitest-készítmények és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
HU 203583B 23 1. táblázat 24 Baktériumok Neutrofüek Antitest Komplement A bevitt baktériumok %-os elroncsolása E. coli 08 és075 + 7D7 U a 0 E.coli 08 és075 + 6F11d + 0 E.coli 08 és075 7D7 + 0 E.coli 08 és075 + 7D7 85% S. marcescens 012és015 + 7D7 — 0 S. marcescens 012és015 + 6F11 + 0 S. marcescens 012és015-7D7 + 0 S. marcescens 012és015 + 7D7 + 85% E. aerogenes Izolátumok(2) + 7D7 — 0 E. aerogenes Izolátumok(2) + 6F11 + 0 E.aerogenes Izolátumok(2) — 7D7 + 0 E. Aerogenes Izolátumok(2) + 7D7 + 85% ^-) - hővel aktivált (56 ”C 30 percen át) humán komplement *{6F11) - Pseudomonas aeruginosa Fisher-féle 2. típus elleni IgM humán monoklonális antitestet tartalmazó tenyészet felülúszó H.In vivo aktivitás Hogy megvizsgáljuk a fenti hipotézist, állatokat gyógyító tanulmányokat hajtunk végre 7D7 antitesttel és legalább egy organizmussal az itt leírt £. coli és E. aerogenes fajok közül. A 7D7 és a negatív kontroll (6F11, Pseudomonas aeruginosa Fisherféle 2. immuntípus elleni IgM monoklonális antitest) antitesteket először koncentráljuk a kialakult tenyészet felülúszókból szüárd ammónium-szulfáttal (50% végső koncentráció) végzett kicsapással (Good A. J. és munkatársai: „Purification of Immunoglobulins and Their Fragments” /Immunglobulinok és fragmenseik tisztítása/, a „Selected Methods in Cellular Immunology” című könyvben, szerkesztők: Mishell B. B. és Shiigi S. M„ W. H. Freeman and Company kiadása, San Francisco, Kalifornia (1980), 279-286. oldal). A kicsapott anyagot steril vízben állítjuk helyre és erőteljesen dializáljuk PBS-sel szemben. Az ammónium-szulfát sóval képzett csapadékban levő IgM antitestet affinitás-kromatográfiával tisztítjuk rágcsáló monoklonális anti-humán IgM antitest affinitás oszlopon. Az oszlop elkészítéséhez 1 g dehidrált, cianogén bromiddal aktivált Sepharose 4B-t (Pharmacia) összekeverünk 15 ml jéghideg, desztillált vízben levő 1 mmól/l-esHCl-lel. A hidratált gélt 30 ml kapcsoló puffernd mossuk (0,1 mól/1 karbonát /NaHCOT 0,5 mól/1 NaCl-ben, pH 8,2), lecsepegtetjük nedves pogácsát képezve és 35 egyesítjük az 1-3 ml kapcsoló pufferban feloldott ammónium-sós csapadékkal. A gél szuszpenziót alaposan keverjük 2 órán át szobahőmérsékleten, ezt követően 200 g-nél centrifugáljuk 5 percen át, és a felüólúszót eldobjuk. A gélt felhasználáshoz elké- 40 szí tjük 1 mosással 0,1 mól/l-es acetát/so puffernd (6,8 g nátrium-acetát trihidrátot és 14,6 g NaCl-t feloldunk 500 ml desztillált vízzel, amely 2,9 ml jégecetet tartalmaz, pH 4,0), 2 mosással kapcsoló puffernd, és két mosással PBS-sel. A gélt Pharmacia 45 C10/10 oszlopba töltjük és 4 °C hőmérsékleten tároljuk felhasználásig. Hogy az immunglobulint megtisztítsuk, 0,5 ml sóval frakcionált anyagot 2,0 ml-re hígítunk PBS- sel, és az affinitás oszlopra tápláljuk. A minta ráter- 50 helését követően az oszlopot PBS-sel mossuk (pH 8,0), amíg az abszorbanciát mérő monitor további fehérjét nem jelez az átáramló folyadékban. A kötött antitestet 2 mól/l-es (PBS-ben oldott) MgCl2-lel eluáljuk, a fehérje-koncentrációt OD2 8-®al min- 55 den frakcióban meghatározzuk, és a csúcsfrakciókat összegyűjtjük. Az antitestet tartalmazó frakciókat sómentesítjük G-25 Sephadex oszlopon, és ha szükséges, mikrokoncentráló centrifugálással (Centricou 30, Amicon Corp., Danver, Massachus- 60 sets) koncentráljuk 1-2 mg/ml-re. A végső preparátumot SDS-poliakrilamid gél elektroforézissel tisztaságra megvizsgáljuk, a fehérjéket ezüstnitráttal festve (Morrissey J. H. „SUver Stain for Proteins in Polyacrylamide Gels: A Modified Procedure with 65 Enhanced Uniform Sensitivity" /A fehérjék ezüst-13
