203583. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bakteriális fertőzések ellen védő emberi monoklonális antitest-készítmények és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
HU 203583B A baktériumokat olyan módon állítjuk elő, hogy vagy 10 ml triptikus szója tápközeget (Tryptic Soy Broth, a Difco Laboratories, Detroit, Michigan cég terméke) inkubálunk 50 pl egy éjszakán át nőtt tenyészettel (ezt alkalmazzuk E. colinál, S. marcescensnél és E. aerogenesnél), vagy Worfel-Ferguson agart (a Difco Laboratories terméke; 2 g/1 élesztőkivonat, 0,25 g/1 MgSo4 1 g/1 NaCl, 20 g/1 szacharóz, 15 g/1 agar) tartalmazó petri-csészére szélesztünk (K. penumoniae-nél). A folyékony tenyészeteknél a csöveket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk rázógépen 3 órán át, amikor 1,5 ml tenyészetet centrifugálunk 1 percen át 10000 xg-vel, az elhasznált tápközeget eldobjuk és az üledéket 3,5 ml Hank-féle kiegyensúlyozott készítmény) szuszpendáljuk, ahol a sóoldat még 0,1% zselatint és 5 mmól/1 HEPES-t is tartalmaz (HBSS/Gél). Az agar lemezen nőtt baktériumoknál a telepeket lekaparjuk a lemezről steril HBSS/Bél-be. A baktérium-koncentrációt mindkét körülmény között nőtt baktériumoknál 3.10Jbaktérium/ml-re állítjuk be, az OD66<át mérve és a megfelelő hígítást végezve el (mintegy 1:50000). Humán neutrofüokat izolálunk von Furth és Van Zwet szerint (”In vitro Determination of Phagocytosis and Intracellular Killing by Polymorphonuclear and Mononuclear Phagocytes” (Fagocitózis és intracelluláris pusztulás in vitro meghatározása polimorfonukleáris és mononukleáris fagociták révén), a Handbook of Experimental Immunology c. könyvben, 2. kötet (szerkesztő Weir D.M.) 2. kiadás, Blackwell Scientific Publication kiadó, Oxford, 36.1.-36.24/1973/), több módosítással. 10 ml heparinizált vér „buffy coat” frakcióját (a heparinnal kezelt vérből centrifugálással elkülöníthető, világos színű sejtekből álló bevonatréteg) Ficoll-Pacquekal alárétegezzük és centrifugáljuk. A vörös vérsejt (RBC) üledéket egyszer mossuk RPMI1640 tápközeggel (a GIBCO cég által gyártott, kereskedelmi forgalomban lévő és az ATTC katalógusban is standard tápközegként szereplő készítmény) és újra szuszpendáljuk azonos térfogatú 37 °C hőmérsékletű RBS-ben. 3 ml üyen szuszpenziót 6 ml 2%-os dextránhoz (37 °C, PBS-ben) adjuk, és a tartalmat gyengéden, de alaposan összekeverjük az aljától a tetejéig. 20 perces, 37 °C hőmérsékleten végzett inkubálás után a vörösvérsejteket hagyjuk leülepedni, a felülúszót (amely neutrofüeket tartalmaz) eltávolítjuk, kétszer mossuk 4 °C hőmérsékletű PBS-ben, egyszer HBSS/Gél-ben, és ugyanebben szuszpendáljuk 5.10 neutrofil/ml koncentrációra. E. coli-val és S. marcescenssel használt komplement forrásaként humán szérumot kétszer adszorbeálunk élő baktérium-készlettel (Bjomson A.B. és Michael J. G. „Factors in Human Serum Promoting Phagocytosis of Pseudomonas aeruginosa I. Interaction of Opsonins with the Bacterium” /Pseudomonas aeruginosa fagocitózist humán szérumban elősegítő faktorok I. Opszoninok kölcsönhatása a baktériummal/, J. of Inf. Dis. 130 Suppl. SI 19-S126 /1974/), amely annak az organizmusnak felel meg, amelyet a vizsgálatban alkalmazunk. Ezt a szérumot tovább adszorbeáljuk felforralt „Zymosan A” reagenssel (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA terméke; vö.: Bjomson, fentebb idézett munka), hogy eltávolítsuk a properdin szérumkomponenst, egy olyan 21 molekulát, amely az alternatív komplement út aktiválásához szükséges. A K. pneumoniae-t és E. aerogenest alkalmazó opszonofagocitás méréshez a komplement forrás nem adszorbeált normál humán szérum 1%-os végső koncentrációban alkalmazva. A túlélő/elroncsolt baktériumok számának meghtározására használt lemezeket úgy készítjük el, hogy először egy 24 üreges lemezt melegítünk 37 °C hőmérsékleten 3-5 órán át. TSB-ben levő 0,4%-os agaróz oldatot készítünk a keveréket 5 percen át autoklávozva, és lehűlni hagyva 50 °C hőmérsékletre vízfürdőben. Mintegy 15 perccel a végső inkubálási periódus vége előtt az opszonofagocitózis vizsgálatban, egy 24 üreges lemezt eltávolítunk a 37 "C hőmérsékletű inkubátorból, 42 ‘C hőmérsékletű meleg lemezre tesszük, és 0,4 ml TSB/agarózt adunk minden egyes üreghez. A lemezt azonnal visszahelyezzük a 37 “C hőmérsékletű inkubátorba úgy, hogy az agaróz sohase hűljön 37 °C hőmérséklet alá. A vizsgálathoz 25 pl 7D7 tenyészet felülúszót és 25 pl megfelelő baktérium-törzset adunk párhuzamosban 96 üreges kerekfenekű mikrotitráló lemezre, és szobahőmérsékleten inkubáljuk 30 percen át. Ezt követi 15 pl humán komplement, 15 pl humán neutrofü (5.10 7ml) és 70 pl HBSS/Gél hozzáadása. A lemez teljes felszínét végigtöröljük sterü gyapot tamponnal, és tapadó műanyag lemez lezárást alkalmazunk, hogy a tel js lemez és az üregek közti területek biztonságosan fedve legyenek, és a lemezt 37 ”C hőmérsékleten 1 órán át forgatjuk. Inkubálás után a lemezeket 5 percen át centrifugáljuk 100 g-vel, a lemez lezárásokat gyengéden eltávolítjuk, és a lemez felületét 70%-os etanolba mártott sterü gyapot tamponnal szárítjuk. 50 pl-t eltávolítunk minden egyes üregből, és a 24 üreges kvantitatív-mérő lemez egyes üregeibe adjuk, amely üregek már tartalmazzák az olvadt (38-40 °C) 0,4% TSB/agarózt (0,4 ml/üreg). Ezeket a lemezeket laposágyas rázógépre helyezzük 1 percre 15 fordulat/perccel, és az agarózt hagyjuk szobahőmérsékleten megszüárdulni 15 percen át. Végül 0,4 ml TSB/agaróz fedőréteget adunk az egyes üregekre, ezt követi egy 15 perces megkeményedési periódus 4 °C hőmérsékleten, melőtt a lemezeket inkubálnánk egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten. 18 óra múlva a telepeket megszámoljuk és az adatokat úgy adjuk meg, mint telepképző egységet (CFU) az egyes körülmények között. Az itt alkalmazott bakteriális szerotípusok, a K. pneumoniae kivételével, csak a 7D7 monoklonális antitest, egy aktív komplement forrás és humán neutrofüek jelenlétében inaktiválódnak (1. Táblázat). Amikor ezt a kísérletet megismételjük számos nem- 7D7 reaktív baktérium szerotípussal, baktérium pusztulást nem figyelünk meg (adatokat nem adunk), így demonstrálva a 7D7 monoklonális antitest funkcionális fajlagosságát és azt a képességét, hogy opszonizálja a baktériumokat és elősegíti fagocitózisukat. Mivel az opszoninok (fajlagos antitestek) és polimorfonukleáris leukociták (neutrofilok) kombinált akciója—úgy tűnik—az elsődleges mechanizmus az ezekre a baktériumtörzsekre való immunitáshoz, ezek az adatok azt sugaüják, hogy a 7D7 antitest, megfelelő beadás után, védelmet nyújthat az itt leírt baktérium szerotípusok halálos kihívása eüen. 22 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 12
