203582. lajstromszámú szabadalom • Eljárás amicin és amicinszármazékok és ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására, valamint ezeket tartalmazó fungicid készítmények
1 HU 203 582 B 2 b) DSM 3816 előtenyészet készítése Erlenmeyerlombikban 5 db 300 ml-es Erlcnmeyer lombikba egyenként 100 ml tápcldatot mérünk, az oldat összetétele 40 g glükóz, 30 g szójaliszt, 2,5 g nátrium-klorid, 2,5 g kalcium-karbonát 1 literre desztillált vízzel feltöltve, pH 7,5-re beállítva, majd sterüizálva, és a tápoldatot 1,5 ml, az a) pont szerint előállított, lehetőleg friss spóraszuszpenzióval beoltjuk. A lombikokat rázógépre helyezzük (180 ford/perc), és 30 °C hőmérsékleten 72 órán át inkubáljulc. c) DSM 3816 főtenyészet előállítása 300 ml-es Erlenmeyer lombikban lévő 100 ml tápközeget — amelynek összetétele 20 g szójaliszt és 20 g mannit 1 liter desztillált vízben, pH-ját 7,5-re állítjuk és sterüezzük — a b) pont szerint előállított előtenyészet 3 ml-ével beoltjuk, és 30 ’C hőmérsékleten rázógépen (180 ford/perc) inkubáljuk. 72 órás tenyésztési idő alatt 300 mg/1 hozamot érünk el. d) DSM 3816 tenyészet készítése fermentorban 13 literes fermentort működtetünk a következő módon: A c) pont szerinti tápközeget 300 fordulat/perc sebességgel keverővei keverjük, 7 liter/perc levegőtvezetünk bele, és 30 °C hőmérsékleten végezzük a tenyésztést. A fermentorban lévő 101 tápközeget 500 ml, a b) pont szerint előállított előtenyészettel oltjuk be. 76 óra tenyésztési idő alatt 400 mg amicin/liter hozamot érünk el. 2. példa 20 liter fermentlé feldolgozása A fermentlevet szűrjük, a micéliumot 3x500 ml etil-acetáttal mossuk, majd 3x500 ml metanollal extraháljuk. Az alkoholt vákuumban ledesztilláljuk, és a visszamaradó 27 g anyagot két Kieselgél oszlopon (500 g) etü-acetátanetanoltvíz 6:1:1 arányú elegyének alkalmazásával kromatografáljuk (középnyomású kromatográfia). így 8,4 g amicint nyerünk. A tenyészlé szűrletét 2x200 liter etü-acetáttal mossuk, majd 3x20 liter 1:1 térfogatarányú kloroformmetanol eleggyel extraháljuk. Az egyesített szerves fázisokat vákuumban sziruppá sűrítjük. A kapott 78 g anyagot Kieselgélen etü-acetát:metanolvíz 6:1:1 arányú elegyével az előzőekhez hasonlóan kromatografáljuk. így 5,3 g amicint és 450 mg megfelelő dezmalonü-vecyületet nyerünk, amelyben R*, minden R2, R3 és R^jelentése hidrogénatom. Az amicinnek a dezmalonil-származéktól nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással való elválasztásánál 220 nm-nél UV-detektálást végzünk, vagy vékonyrétegkromatográfiás eljárással azonosítjuk az oszlopról lejövő anyagokat. Butanol:jégecet:víz 4:1:5 elegy alkalmazásakor az amicin Rf értéke 0,2, a megfelelő dezmalonil-származéké 0,27. Amicin: MS (FAB)/MH+-1229 13C-NMR (75 MHz) (CD3OD): 8- 176,9; 174,2; 174,1; 171,7; 171,3; 156,6; 99,1 ppm. IR (KBr) (cm*1)- 3400, 2860, 1720, 1640, 1600, 1460,1385. Dezmalonü-származék: MS (FAB): MH+-1057. 13C-NMR (75 MHz) (CD3OD): 8- 177,1; 156,6; 99,1 ppm. 3. példa A dezmalonü-vegyület (R1, minden R2, R3 és R4 jelentése hidrogénatom) és az ennek megfelelő, a 22/23 helyzetben dehidratált származék előállítása 1 g (0,81 mmól) amicint 75 ml metanolban 100 mg nátrium-hidriddel 24 órán át szobahőmérsékleten keverünk. Az elegyet 5 n hidrogén-ldoriddal semlegesítjük, majd vákuumban lepároljuk róla az alkoholt. A kapott szirupot 100 g Kieselgélen etil-acetát:metanol:víz elegyével kromatografáljuk (800 ml 15:2:1 arányú és 2000 ml 8:2:1 arányú elegy). (A frakciók azonosítását, és ennek alapján elkülönítésüket a 2. példában megadott módon végezzük). Metanol-etü-acetát elegyből való átkristályosítás után 72%-os hozammal 720 mg dezmalonü-vegyületet nyerünk (amelynek fizikai állandói a 2. példa szerintivel azonosak), továbá 8%-os hozammal 80 mg a fenti dezmalonü vegyületnek megfelelő, a 22/23 dehidratált vegyületet [(Ha) képletű vegyület]. MS (FAB): MH+-1039 13C-NMR (75 MH) (CD3OD): 8= 177,1; 156,6; 99,1 ppm. 4. példa R3-metü-amicin előállítása 1 g (0,81 mmól) amicint 1,5 ml acetü-klorid és 75 ml metanol elegyével 15 percig szobahőmérsékleten keverünk. Az elegyet 5 n nátrium-hidroxiddal semlegesítjük, majd vákuumban sziruppá sűrítjük. A visszamaradó anyagot nagynyomású kromatográfiás eljárással tisztítjuk RP-C-18 tölteten, eluensként 30 percig 6:4 térfogatarányú metanol-víz elegyet alkalmazunk, majd metanol-víz gradienst 6:4-99:1 koncentrációtartomány között változtatunk 10 perc alatt, majd 30 percig 99:1 térfogatarányú metanol-víz elegyet alkalmazunk. így 70%-os hozammal 760 mg R3- metü-amicint nyerünk. MS (FAB): MH+= 1243 13C-NMR (75 MHz, CD3OD): 8- 176,7; 174,5; 174,2; 171,1; 156,5; 102,6 ppm. 5. példa Az R3-etil-dezmalonü-származék (R1, minden R2 és R4 jelentése hidrogénatom, R3 jelentése etilcsoport) és a dietil-származék (R1, minden R2 jelentése hidrogénatom, R3, R4 jelentése etilcsoport) előállítása 500 mg, a 3. példa szerint előállított dezmalonU- származékot 0,1 ml acetü-kloridot tartalmazó 5 ml etanolhoz adunk, és az elegyet közvetlenül Kieselgélre visszük, kloroform és metanol 8:2 térfogatarányú elegyével kromatografáljuk. 80%-os hozammal 400 mg R3-etü-dezmalonü-származékot és 14%-os hozammal 70 mg dietil-származékot nyerünk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
