203580. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a GE 2270 antibiotikum A faktor és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására

HU 203580B

23

24

tonitrikvíz elegyben oldjuk és az oldatot felvisszük egy HPLC kromatográfiás rendszerre, amely egy szüanizált szüikagél oszlopot (Lichrosorb RP 18,7 ixm, 250 x 10 mm, Merck, Darmstadt) tartalmaz.

Az eluálást egy olyan elegy lineáris gradiensével 5

végezzük, amely 50-85% A oldatot tartalmaz B oldatban, 20 perc alatt, kb. 4 ml/perc áramlási sebesség mellett. Az A oldat acetonitrü és 18 mM 6 pH-jú nátrium-foszfát puffer 70:30 (térfVtérf.) elegye, míg a B oldat acetonitrü és 18 mM 6 pH-jú foszfát 10 puffer 10:90 (térfAérf.) elegye.

Az oszlopot hozzákapcsoljuk egy 330 nm-en mérő Perkin Elmer LC 85UV detektorhoz. Összeöntjük 11 egymásutáni kromatográfiás futtatás homogén tartalmú frakcióit és az oldatokat csökkentett 15 nyomáson betöményítjük, az acetonitrü eltávolítására. így maradék oldatokat kapunk, amelyek különböző mennyiségű GE 2270 antibiotikum A faktort tartalmaznak. Ezeket az oldatokat kétszer extraháljuk azonos térfogatú etüacetáttal és az antibi- 20 otikumot a tömény szerves fázisból petroléter hozzáadásával való kicsapással kapjuk meg. Szűréssel való kinyerés és szárítás után 27 mg GE 2270 antibiotikum A faktort kapunk, melynek fizikai kémiai állandói azonosak a fentiekben megadottakkal. 25

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás GE 2270 antibiotikum A faktor előál- 30

lítására, amely a következő jeüemző tulajdonságokat mutatja be:

A) az 1. ábrán látható UV abszopciós spektrum,

amely a következő abszorpciós maximumokat mutatja: 35

Ex IcnLambdama&un) 0.1MHC1 245(váü, 310

0.1MKOH 245(váü)313

7,4 pH-jú 245(váü)314

foszfát puffer 40

metanol 265 244 (váü) 310

B) A 2. ábrán látható IR abszorpciós spektrum

nujol pólyában, amely a következő abszorpciós maximumokat mutatja (cm-): 3700-3060; 3060- 2660 (nujol); 1650; 1590-1490; 1490-1420 (nujol); 45

1375 (nujol); 1310; 1245; 1210; 1165; 1090; 1060;

1020; 970; 930; 840; 810; 750; 720; 700.

E spektrumban a főbb funkcionális IR abszorpciós sávok a következőképpen minősíthetők: v, cm eredet 50

3600-3100 1650 1545

1525,1495 1250,1205 870

745,700 _____

C) A 3. ábrán látható %-NMR spektrum a következő jel-csoportokat (ppm-ben) mutatja 500 MHz-en, DMSO-d 6-ban felvéve: (DMSO- hexadeutero-dimetü-szulfoxid), belső standardként (0,00 ppm) TMS (tetrametü-szüánt) használva. Zárójelben az egyes jelekhez tartozó protonok számát tüntetjük fel:

vNH, vOH Iamid(vC-O) heterociklus vC-C és vC-N II amid (SNH) aromás 8CH heterociklus yCH aromás yCH

55

60

65

9,02 (1), 8,68 (1), 8,70 (1), 8,57 (1), 8,50 (1), 8,43 (1), 8,37 (1), 8,26 (1), 8,25 (1), 7,4-7,20 (9), 6,96 (2), 6,03 (1), 5,30-5,18 (3), 5,01 (1), 4,97 (2), 4,80 (1), 4,56(1),4,30(1),4,26(1),3,98(1), 3,81(1),3,79(1), 3,38 (3), 2,72 (1), 2,58 (3), 2,48 (3), 2,16 (1), 2,13 (1), 1,96 (2), 1,88 (1), 1,34 (1UL87 (3), 0,84 (3).

D) A 4. ábrán látható x C-NMR spektrum a következő jel-csoportokat mutatja (ppm-ben) 125 MHz-en, DMSO-dbban, belső standardként (0,00 ppm) TMS alkalmazásával. Q jelentése kvatemer szénatom vagy C-0 csoport: 173,69, Q; 171,10, Q; 169,83, Q; 169,51, Q; 168,45, Q; 168,26, Q; 167,84, Q; 165,68, Q; 164,75, Q; 161,40, Q; 161,23, Q; 160,46, Q; 160,29, Q; 159,35, Q; 153,42, Q; 150,31, Q; 150,11, Q; 149,41, Q; 146,93, Q, 144,73, Q; 143,75, Q, 142,10, Q; 141,78, Q; 141,33, CH; 140,97, Q; 139,53, Q; 128,68, CH; 127,99, 2(CH); 127,67, Q; 127,67, CH; 126,88, CH; 126,76, 2(CH); 123,17,CH; 118,66,CH; 116,42,CH; 73,81, CH; 69,41, CH2 67,97, CH; 67,36, CH2 60,12, CH; 58,63, CH3 58,24, CH; 55,41, CH; 48,15, CH; 47,03, CH2 41,19, CH2 37,60, CH2 34,06, CH; 29,76, CH2 25,85, CH3 24,28, CH2 18,49, CH3 17,98 CH311.99, CH3

E) Retenciós idő (Rft 14,9 perc, fordított fázisú HPLC-vel a következő körülmények között végezve a vizsgálatot:

oszlop: Ultrasphere ODS (fordított fázisú szüanizált szüikagél; 5 jxm; Altex, Beckman); 4,6 mm (belső átmérő) x 250 mm;

első-oszlop: Brownlee Labs RP 18 (oktadecü-szilán szüikagél, 5 pjn);

A eluálószer: acetonitrü: 18 mM—pH 7,0-ra beáüított—nátrium-foszfát 70:30 (térfAérf.),

B eluálószer: acetonitrü: pH 7,0-ra beáüített 18 mM nátrium-foszfát puffer 10:90 (térfAérf.),;

az eluálás módja: az A eluálószer lineáris grádiense a B eluálószerben, 45-70% között, 20 perc alatt;

áramlási sebesség: 1,8 ml/perc;

UV detektor: 254 nm;

belső standard: kloramfenikol (Rfe 3,7 perc).

F) elemanalízis- a minta előzetes, kb. 140 "C-on közömbös atomszférában való szárítása után — a következő összetevőkre mutat: C, H, N, S.

G) 0,37 Rf érték a következő kromatográfiás rendszerben:- diklór-metán:metanol 9:1 (térfAérf.);- szüikagél lemezek (szüikagél 60F254Merck

Co.);- kimutatás: 254 nm-es UV fény; jód-gőz hatására sárga folt vagy bioautográfia, B. subtüis ATCC 6633 alkalmazásával, Davis-f. minimál-táptalajon,- belső standard: kloramfenikol (Rfl),56).

H) FAB-MS elemzés: a proton ált molekula ion a legkisebb tömegű izotópot m/z 2390,3 ± 1 daltonnái mutatja. 800 m/z tömeg-egység fölött minden csúcs (eltekintve az izotóp csúcsoktól) a spektrumban a molekula-ion 21%-ánál kisebb mennyiségű. Az elemzést Kratos Ms-50 kettős fókuszáló tömegspektrométerrel végezzük, a következő kísérleti körülmények között: Xe gyors atom bombázás 6 Kv mellett;

glicerin mátrix;

pozitív ionizációs mód.

13