203579. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fúziós proteinek előállítására
HU 203579B mas módszer főleg a kívánt protein aminosavszekveniájától függ. Amennyiben a protein nem tartalmaz metionint, Y helyén Met állhat, és klór-, illetve brómciánnal végzett kémiai hasítás lehetséges. Ha az Y jelű közbenső tag a karboxilterminálisan ciszteint tartalmaz, vagy Y jelentése Cys, cisztein-specifikus enzimmel vagy kémiailag, például előzetesen végzett specifikus S-cianüezés után lehet hasítani. Amennyiben az Y jelű áthidaló tag a karboxilterminálisan triptofánt tartalmaz, vagy Y jelentése Trp, a kémiai hasítás N-bróm-szukcinimiddel lehetséges. Az aminosav-szekvenciában Asp-Pro-t nem tartalmazó és máskülönben savval szemben eléggé ellenálló proteineket ismert módon proteolítikusan hasítunk. Ez úton N-terminálisan prolint, illetve C- terminálisan aszparaginasvat tartalmazó proteint, azaz módosított proteint állíthatunk elő. Az Asp-Pro-kötést még jobban savérzékennyé lehet tenni, ha az áthidaló tag jelentése (Asp)n-Pro vagy Glu-(Asp)n-Pro, ahol n jelentése 1,2 vagy 3. Enzimes hasításra is ismertek példák, és módosított, azaz javított specifitású enzimek alkalmazása is lehetséges [C. S. Craik és mts-i, Science 228 (1985), 291-297], Ha kívánt eukarióta peptidként humán proinzulint akarunk nyerni, az Y jelű szekvenciaként olyan peptidszekvenciát választhatunk, amely a proinzulin N-terminális aminosavához (Phe) kapcsolódó, tripszinnel lehasítható aminosavat (Arg, Lys) tartalmaz, így Y lehet például Ala- Ser-Met-Thyr-Arg, és az arginin-specifikus hasítást tripszin proteázzal lehet végezni. Amennyiben a kívánt proteinben az De-Glu-Gly- Arg aminosavszekvencia nem szerepel, a hasítás az Xa faktorral is végezhető (0161937 sz. európai szabadalmi bejelentés). A fúziós proteint alkalmas expressziós rendszerben ismert módon exprimál juk. Bármely gazdavektor-rendszer alkalmas, tehát például emlős sejtek és mikroorganizmusok, így élesztők, de előnyösen baktériumok, különösen előnyösen E. Coli. A kívánt proteint kódoló DNS-szekvenciát ismert módon olyan vektorba építjük, amely a választott expressziós rendszerben jó expressziót biztosít. Ha a gazdasejt baktérium, előnyösen a X-fág Lac, Tac, Pi vagy Pr csoportjából választunk promotort és operátort, alkalmasak hsp, omp vagy szintetikus promotorok is, amelyeket a 3 430 683. számú európai szabadalmi bejelentés) ismertet. Előnyös a tac promotor-operátor-szekvencia, amely most már kereskedelmi termék (pl. a pKK223-3 expressziós vektor, Pharmacia, „Molecular Biologicals, Chemicals and Equipment for Molecular Biology, 1984, 63. old.). A fúziós protein expressziója során célszerű lehet, ha az ATG indító kodont követő első aminosavak egyes triplettjeit megváltoztatjuk, hogy a küldönc RNS szintjént esetleg bekövetkező bázispár képződést megakadályozzuk. Az ilyen módosítások, mint ahogy a 2-IL-részben egyes aminosavak megváltoztatása, kihagyása vagy hozzáadása is szakember számára ismert műveletek, és a találmány ezekre is kiterjed. Az alábbi példákkal a találmányt a rajzok alapján közelebbről ismertetjük. Az 3 1. ábra, valamint annak folytatása, az la. ábra a hirudin-szekvenciát tartalmazó fúziós proteint kódoló pK360 plazmid előállítására szemlélteti, a 2. ábra, valamint annak folytatása, a 2a. ábra a pK410 plazmid szintézisét mutatja; ez a plazmid szintén egy, a hirudin aminosav-sorozatát tartalmazó fúziós proteint kódol; a 3. ábra, és folytatását képező 3a-3c. ábrák a pH 15,16,20 és 30 plazmidok szerkesztését ábrázolják, e plazmidok a majom-proinzulins aminoasv-sorozatát tartalmazó fúziós proteint kódolnak. A 4. ábra a pH 100 plazmid szintézisét ábrázolja, a benne kódolt fúziós protein a hirudin aminosav-sorozatát tartalmazza. Az 5. ábra, valamint annak folytatása, az 5a. ábra a pK 370 plazmid szerkesztését mutatja; szintén olyan fúziós proteint kódol, amely a hirudin-szekvenciát tartalmazza, míg a 6. ábra, valamint annak folytatása, a 6a. ábra a pHIOl plazmid szintézisét szemlélteti; e plazmid egy, a majom-proinzulin aminosav-sorozatát tartalmazó fúziós proteint kódol. A példákban alkalmazott vektorok, plazmidok és baktériumok az alábbiak szerint hozzáférhetők: pKK 223-3 és pUC 12: a kereskedelmi forgalomban kapható plazmidok, a Pharmacia Inc. USA-beli cég 1984-ben kiadott gyártmányismertetőjének 58., illetve 63. oldalán szerepelnek. pKK 177-3: Amannetal., Gene 25,167/1983 p 159/6:34 19 955 sz. NSZK-beli közrebocsátási irat. A 3. példában említett (26) jelű DNS-szekvencia előállítását is ez a közrebocsátási irat ismerteti. E. coli HB101 E. coli MM 294: az ATCC-katalógusban 33694, illetve 39604 szám alatt szerepel. A rajzok nem méretarányosak, főlega polilinkerek feltüntetésekor „nyújtás” történt. A példákban említett műveletek egy részét T. Maniatis, E.F. Fritsch és J. Sambrook „Molecular Cloning, a Laboratory Manual” c. könyvében (Cold Spring Habor Laboratory, New York, 1982) részletesen és reprodukálhatóan leírták. Tekintettel arra, hogy a következő példákban e műveletek többszörösen szerepelnek, az alábbiakban hivatkozási listát közlünk, amelyben hivatkozási szám mellett az adott műveletek és a fent említett könyv egy-egy oldalszáma szerepel; a példa vonatkozó részében csak a hivatkozási számot adjuk meg, amelyhez a lista alapján a pontos irodalmi hely nehézség nélkül hozzárendelhető. 1. DNS vágása, plazmid nyitása: 104. oldaltól kezdve, valamint az enzimet előállító cég prospektusa 2. DNS utókezelései 2.1 Rövidítés 2.1.1 Exonuklázos kezelés rövidítés céljából: A BamHl enzimet alkalmaztuk, lásd 135. oldal 2.1.2 túlnyúló végek levágása: 140. oldal 2.1.3 túlnyúló végek feltöltése: 113. oldal 3. DNS-fragmensek izolálása A DNS-fragmensek szétválasztása gél-elektroforézis útján, agaróz-gél segítségével (150-172. oldal), vagy - rövid, azaz 1 kb-nál kisebb fragmensek ese4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
