203579. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fúziós proteinek előállítására
HU 203579B tén -poliakrilamid-gél segítségével (173-181. oldal) történik. 4. Ligálás: 146., valamint 390-301. old. 5. E coli sejtek transzformálása: 249-251. old. 6. Azonosítás 6.1 Szélesztés: 55-61., 68-79. és 249-250. old. 6.2 Restrikciós elemzés: 104. old. 6.3 szekvencia elemzés: 475. old. A hivatkozási számokat szögletes zárójelben [] tüntetjük fel, hogy a rajzokra való hivatkozásoktól megkülönböztethetők legyenek. 1. példa A lac-represszort (P. J. Farabaugh, Nature 274 (1978), 756-769) a pKK 177-3 plazmidba (Amann és munkatársai, Gebe 25 (1983) 167) juttatva a pJF 118(1) plazmidot kapjuk (1. ábra: P 35 26 995.2. sz. NSZK-beli szabadalmi bejelentés 6. példája és 6. ábrája). Ezt az Ava I restrikciós enzim kizárólagos vágóhelyénél megnyitjuk [ 1 ] és ismert módon exonukleázzal kezelve [2.1.1] mintegy 1000 bázispárral rövidítjük. Ligálás [4] után a pEW 1000 (2) plazmidot (1. ábra) kapjuk. A plazmid a teljes lac-represszor-gént tartalmazza, ugyanakkor a kicsinyítés következtében szignifikánsan magasabb darabszámban fejeződik ki, mind a kiinduló plazmid. A pKK 177-3 plazmid helyett a már említett, kereskedelmi forgalomban levő pKK223-3 plazmidból is indulhatunk ki, ez esetben is a lac-represszor beépítése után a plazmidot rövidítjük. a pEW 1000 plazmidot (2) az EcOR I és Sal I resktrikciós enzimmel megnyitjuk (3) [ 1 ]. A hirudint kódoló plazmidot (4) (előállítva a 34 29 430 sz. NSZK-beli közrebocsátási irat 4. példája és 3. ábrája szerint: ez a 0 171 024 szám alatt közzétett európai szabadalmi bejelentésnek felel meg), az Acc I és Sal 1 restrikciós enzimmel megnyitjuk [1], és az (5) számú, majdnem teljesen a hirudin-szekvenciából álló kis fragmenst elkülönítjük [3]. A pl59/6 plazmidot (6) (előállítva a 34 19 995. számú NSZK-beli közrebocsátási irat 4. példája szerint; ez a 0 163 249. szám alatt publikált európai szabadalmi bejelentésnek felel meg) az Eco Rí és Pvu I restrikciós enzimmel megnyitjuk [1], és a 2- IL-szekvencia legnagyobb részét tartalmazó kis fragmenst (7) elkülönítjük [3], Ezt a rész-szekvenciát - a későbbiekben más rövidített 2-IL-szekvenciákat is - a rajzokon „AIL2”-ként jelöltük meg. A (3), (5) és (7) jelű szekvenciát, valamint az la. rajzon (8) szám alatt szereplő szintetikus DNS- szekvenciát T4-ligázzal kezeljük [4], ami a pK360 plazmidhoz (9) vezet. A ligális termékét kompetens E. coli sejtekbe juttatjuk [5] és a sejteket 25 p-g/ml ampicillint tartalmazó tápagar lemezeken szélesztjük [6.1 ]; a kiónok plazmid DNS-ét restrikciós [6.2] és szekvenciaelemzéssel [6.3] jellemezzük. A (9) jelű plazmidot tartalmazó E. coli transzformáit egyedekből álló, 50 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-közegben (J. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972) egy éjszakán át tenyésztett kultúrából mintegy 1:100 új tenyészetet állítunk be, és a növekedést OD-méréssel figyeljük. OD = 0,5 értéknél a tenyészethez annyi izopropil-ß-D-galaktopiranozidot 5 (IPTG) adunk, hogy koncentrációja a közegben 1 mmól legyen. 150-180 perc elteltével a baktériumokat lecentrifugáljuk, 5 percen át pufferoldatban (7 M karbamid, 0,1 % SDS, 0,1 M nátrium-foszfát, ph 7) forraljuk, majd mintákat SDS-gél-elektroforézis lemezre viszünk. A (9) jelű plazmidot tartalmazó baktériumok az elektroforézis során olyan proteinsávot adnak, amely a várt fúziós protein móltömegének megfelel. A baktériumok feltárása (French Press; ^R'Dyno-maIom) és centrifugálása után a fúziós protein a csapadékban van, így a felülúszó rész eltávolításával a többi protein zömét már elválasztjuk. Az elkülönítés után brómciános hasítással felszabadítjuk a kívánt hirudin-peptidet. Ehhez 4 g nedves fúziós proteint (szárazanyag tartalom kb. 25 tömeg%) 10 ml 98-100%-os foszforsavban oldunk, és az oldathoz 0,5 g brómciánt adunk. Az elegyet 40 °C-on 6 órán át reagálni hagyjuk, utána 100 ml vízzel hígítjuk és fagyasztva szárítjuk. A BrCN-hasítás során kapott termék 5 g-ját 0,1 liter pufferben (6 M karbamid, 0,1 M trisz-HCl, pH 8,5) oldjuk, az oldatot 30 °C-ra melegítjük, és 5 g nátrium-szulfotot, valamint 1,25 g nátrium-tetrationátot adunk hozzá. 90 perc elteltével az oldatot azonos térfogatú vízzel hígítjuk és FRAKTOGEL TSK DEAE-650M gélen kromatograf áljuk. Eluensként 0,05 M-tól 0,5 M-ig változó NaCl-gradienst (6 litert) alkalmazunk. A hirudin-tartalmú frakciókhoz a hétszeres mennyiségű acetont adva a proteint kicsapjuk. A csapadékot 20 ml vízzel mossuk, majd fagyasztva szárítjuk. A protein hajtogatása, valamint a diszulfid-hidak kialakítása céljából a kapott S-szulfonátot 50 ml puffer-oldatban (8 M karbamid, 0,02 M trisz- HCl, pH 7,5) oldjuk, és néhány csepp oktanol adagolása után 15 percen át nitrogéngázt vezetünk az oldaton keresztül. Ezt követően 16 ml 2-merkaptoetanolt adagolunk, és az elegyet szobahőmérsékleten egy órán át keverjük. Az oldatot 5x60 cm méretű SEPHADEX G25 adszorbenssel töltött kromatográfiás oszlopra adjuk és 300 ml puffer-oldattal (0,05 M glicin/trisz-HCl, pH 8,5, 3 mM glutation, 0,5 mM glutation-diszulf id) eluáljuk. Az eluátumot 4 °C-on 2 napon keresztül állni hagyjuk, utána ultraszűréssel töményítjük. Ezt követően a protein-elegyet fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiásán (szilikagél RP 18, eluens: 20%-tól 50%ig változó acetongradiens 0,1%-os trifluor-ecetsavban) szétválasztjuk és a hirudin-tartalmú frakciókat összegyűjtjük. A proteint szekvencia-elemzéssel [6.3] azonosítjuk. Az itt megadott indukciós körülmények rázott tenyészetre érvényesek; nagyobb térfogatú fermentálás esetén megfelelően megváltozott OD-értékek és adott esetben némiképp módosított IPTG-koncentrációk alkalmazandók. 2. példa A (4) plazmidot (1. ábra) AccI enzimmel megnyitjuk [1], és a túlnyúló végeket Klenow-polimerázzal feltöltjük [2.1.3]. Ezt követően Sac I enzimmel vágjuk [ 1 ], így a hirudin-szekvencia legnagyobb részét tartalmazó (10) fragmenst kapjuk. A kereskedelemben kapható pUC 13 vektort a Sac I és Sma I 6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
