203579. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fúziós proteinek előállítására
1 HU 203579B 7. táblázat 2 A találmány tárgya eljárás eukarióta proteinek előállítására géntechnológiai úton. A proteinek expresszióját a 2-interleukint kódoló DNS-ból származó „nyitott olvasóraszter” segítségével végezzük. Kisebb (mintegy 15 000 daltonig terjedő) mól tömegű, diszulfid-hidakat tartalmazó eukarióta proteinek géntechnológiai előállításakor baktériumokban a hozam gyakran alacsony. Feltételezhető, hogy a gazdasejt saját proteáz enzimjei a képződött proteint hamar lebontják. Ezért célszerű olyan génszerkezet létrehozása, amely fúziós proteint kódol; a fúziós protein nem kívánt része a gazdasejt egyik proteinje, ezt a részt később lehasítják. Azt találtuk, hogy lényegében a 2-interleukin N- terminális részének első 100 aminosavának megfelelő más. Primer termékként tehát teljesen vagy legnagyobb részében eukarióta proteinből álló fúziós protein keletkezik. Feltehető, hogy a gazdasejt a protein idegen voltát nem fedezi fel, ezért nem is bontja le a terméket. Előnyös továbbá, hogy a találmány szerint előállított fúziós proteinek nehezen oldódó, illetve oldhatatlan vegyületek, ezért egyszerű módon, célszerűen centrifugálással választhatók el az oldott proteinek mellől. Tekintve, hogy a fúziós protein interleukinrésze csak „ballasztként” szerepel, nem játszik szerepet az a tény, hogy az interleukin biológiailag aktív molekula. Ezért nem szükséges az interleukinnel való teljes azonosság. A találmány céljaira elég, ha lényegében az N-terminális rész első 100 aminosav van jelen. így az N-terminális részt olyan módon variálhatjuk, hogy a kívánt protein lehasíthatóvá váljék (amennyiben az N-terminálishoz kötődik). Ha a kívánt protein - a szokásos módon - C-terminálisan kötődik a fúziós proteinben, a lehasíthatóság érdekében a C-terminálist módosítjuk. A humán 2-interleukint (az alábbiakban 2-IL) kódoló természetes DNS-szekvencia az EP-A1-0 091 539 szám alatt publikált európai szabadalmi bejelentésből ismert. Az említett bejelentés égés és patkány 2-IL-re is kiterjed; ez az emlős 2-IL szintén alkalmazható a találmány szerinti protein-szintézishez, előnyösebb azonban, ha szintetikus DNS-ből indulunk ki. Különösen előnyös a 0 163 248 szám alatt publikált európai bejelentésnek megfelelő, köre nem bocsátott 34 19 995 számú NSZK-beli szabadalmi bejelentésben leírt DNS, amely humán 2- IL-t kódol. Ezt a szekvenciát az I. mellékletben tüntettük fel. E szekvenicának az az előnye, hogy kodonjai a leggyakrabban használt gazdasejtnek, az E. coli adottságaihoz illenek, továbbá, hogy néhány restrikciós endonukleázos vágóhelyet tartalmaz, amely a találmány szerinti eljárás során felhasználható. Az alábbi I. táblázatban a DNS-eleje és 100. aminosava közötti részben fellelhető előnyös vágóhelyeket tüntettük fel, a két vágóhely közötti részt kívánt esetben módosíthatjuk, a fent említett szabadalmi bejelentésben ismertetett további vágóhelyek felhasználásával. Restrikciós enzim felismerés szekvenciája A felismerés szekvenciája első nukleotidjének helye a kódoló szálon Aha II, Ban I 5’ 3’ Hae II, Nar I Ban n, Sac I GGCGCC 8 SstI GAGCTC 291 Hhal GCGC 9 HinfI GACTC 35 Pvul CGATCG 346 Taql TCGA Amennyiben a Ban II, Sac I vagy Ssr I nukleázt alkalmazzuk, mintegy 95 aminosavat kódoló 2-IL- részszekvenciát kapunk. A lánc ezen hossza általában elég ahhoz, hogy oldhatatlan fúziós protein keletkezzék. Olyan esetben, ahol - például hidrofüeukarióta protein esetén - az oldódás még mindig túl jó, de a minél kevesebb ballaszt termelése érdekében a C-terminálishoz közelebb eső vágóhelyet nem kívánunk felhasználni, az N- és/vagy C-terminális végét képező DNS-szekvenciát megfelelő adapter, illetve linker alkalmazásával meghosszabbíthatjuk, úgyszólván méretre szabott ballasztot alakítva ki. Természetesen a DNS-szekvenciát többé-kevésbé a teljes terjedelmében is hasznosíthatjuk, így - adott esetben módosított - biológiaüag aktív 2-IL-t kapunk melléktermékként, illetve kettős hatású proteint alakítunk ki, amely a 2-IL hatáson túlmenően a kódolt protein hatásával is rendelkezik. A találmány tárgya tehát eljárás la és Ib képletű fúziós proteinek előállítására Met-X-(Y)m-Z Met-Z-(Y)m-X (la) (ib) ahol Z a célfehérjét vagy -peptidet jelenti, X jelentése 2-IL, előnyösen emberi 2-11 első 90- 133 aminosavának szekvenciája, illetve ennek legfeljebb 6 aminosav cseréjével megváltoztatott variánsa, Y jelentése 1 -4 aminosavból álló híd, amely kémiai úton vagy enzimesen hasítható, illetve lehasítható és m jelentése zéró, ha a kívánt proteinhez szomszédos aminosav a kívánt protein lehasítását lehetővé teszi, máskülönben m jelentése 1,2,3 vagy 4. Ahogy az (la) és (Ib) képletek mutatják és a fentiekben már említettük, a kívánt proteint a 2-IL-rész előtt, de utána is kifejezhetjük. Az egyszerűség kedvéért az alábbiakban főleg az első lehetőséget ismertetjük, amely a fúziós proteinek hagyományos előállításának felel meg; e klasszikus” módszer ismertetése azonban a másik lehetőséget nem zárja ki. A fúziós protein hasítása önmagában ismert módon kémiai vagy enzimes úton történhet. Az alkal-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
