203578. lajstromszámú szabadalom • Eljárás Streptomycesben és más organizmusokban alkalmazható carG karbomicin bioszintetikus gén előállítására
1 HU 203 578 B 2 tetikus gén kódoló szekvenciájával, hogy olyan hibrid antibiotikum bioszintézis-út gént állítsunk elő, amely más Streptomyces fajokban működik, így állítva elő hibrid antibiotikumokat. így az itt leírt plazmidokban levő gén egyedi elemei a jelen találmány fontos részeit tartalmazzák. Azok, akik a szakterületen jártasak, tudják, hogy az NRRL B-18169 letéti számon deponált carG szekvenciát lehet alkalmazni DNS vizsgáló minták előállítására is, más bioszintetikus gént tartalmazó gén-szegmensek kinyerésében való alkalmazásra, különösen olyan gén-szegmensekére, amelyek makrolid bioszintetikus géneket kódolnak. Ezen kívül a Streptomyces thermotolerans törzsek sokfélesége miatt mind a természetben, mind a laboratóriumban, a carG gén sokféle alléi variánsait lehet izolálni, a jelen találmány szerinti carG gént tartalmazó anyagot adva. Ezek az alléi változatok, amelyek olyan aminosavszekvenciával rendelkező génterméket kódolnak, amelyek csak néhány gyökben térnek el a carG géntermék aminosavszekvenciájától, funkcionálisan ekvivalensek a je- 5 len találmány szerinti carG génnel. Sokféle ismert Streptomyces replikont alkalmazhatunk a carG génnel összekapcsolva, hogy a jelen találmány szerinti kifejező vektorokat megalkossuk. A VI. Táblázat bemutató, d e nem korlátozó listája azoknak 10 a plazmidoknak, amelyekből Streptomyces replikonokat lehet kapni. Azok, akik a szakterületen jártasak, tudják, hogy amíg a replikon funkció nincs elpusztítva, a plazmidok egészét vagy részét lehet alkalmazni olyan vektorok megalkotására, amelyek a jelen talál- 15 mány szerinti carG gént tartalmazzák. A plazmid-tartalmú gazdaszervezetek és a deponálási számok szintén a VI. Táblázatban vannak felsorolva. VI. Táblázat Streptomyces plazmidok Plazmid Gazdaszervezet Letéti szám SCP2 Streptomyces coelicolor A3(2) NRRL 15042 SCP2* Streptomyces coelicolor M110 NRRL 15041 pEL7 Streptomyces ambofaciens/pEL7 NRRL 12523 pUCő Streptomyces espinosus NRRL 11439 pUC3 Streptomyces 3022A NRRL 11441 SLP1 Streptomyces lividans NOB* 11417 pNMIOO Streptomyces Virginiáé NRRL 15156 pEL103 Streptomyces granuloruber A39912.13/pEL103 NRRL 12549 pU702 Streptomyces licidans ATCC**39155 ♦National Collection of Industrial Bacteria (NOB), Torry Research Station, Post Office Box 31, 135 Abbey Road, Aberdeen AB98DB, Skócia, Egyesült Királyság ♦♦American Type Culture Collection, Rockville, Maryland 20852 A jelen találmányt bemutató vektorok megalkotásához alkalmazott restrikciós fragmentumokat könynyen lehet módosítani, hogy megkönnyítsük a ligálást. így pl. molekuláris kapcsolókat alkalmazhatunk egy adott carG bioszintetikus gént tartalmazó restrikciós fragmentumhoz, vagy egy olyan DNS-hez, amely vektor replikációs vagy integrációs funkciókat tartalmaz, így az ez után következő ligáláshoz könnyen Id lehet alakítani fajlagos helyeket. Ezen kívül különböző bioszintetikus gént tartalmazó restrikciós fragmentumokat, replikációs origót, vagy egy adott vektor kromoszomális integrációjához adott szekvenciákat lehet módosítani bizonyos nukleotidok hozzáadásával, eltüntetésével vagy' helyettesítésével, hogy megváltoztassunk jellemzőket és különböző restrikciós helyeket szolgáltassunk DNS ligálásához. Azok, akik a szakterületen jártasak, ismerik a nuldeotid-kémiát és a genetikai kódot, így tudják, hogy mely nukleotidok cserélhetők ki egymás között és müyen DNS módosítások kívánatosak bizonyos speciális célok elérésére. Meg kell jegyeznünk, hogy egy adott carG bioszintetikus gént tartalmazó estrikciós fragmentum nem korlátozódik egy klónozó vektor egy adott helyzetére mindaddig, amíg a kritikus, vektorral szabályozott funkciók el nem roncsolódnak. Azok, akik a szakterületen jártasak, tudják és könnyen meg tudják határozni, hogy a vektoron mely helyek előnyösek a ligáláshoz vagy egy adott carG gént tartalmazó restrikciós fragmentum beiktatásához. A carG gént természetesen lehet alkalmazni más vektorok megalkotására is, nemcsak plazmidokéra. A 0C31 fág jól ismert Streptomyces fág, amely kiváló 45 forrása a kiindulási anyagnak integratív karbomicin rezisztencia átadó vektorok megalkotásához, amelyek további példákat nyújtanak a jelen találmányhoz. A 0C31 fág egyik származéka, a pKC331 fazmid, különösen előnyös az üyen integráló vektorok megalkotá- 50 sához, és ezt E. coli K12 BE447/pKC331 -bői (NRRL B-15828) kaphatjukA 0C31 típusú fágok integratív vektorok, és ezeket könnyen lehet módosítani, hogy beépítsük a carG gént és így carG aktivitást vigyünk át Streptomcesbe. Még azok a plazmidok is, amelyek 55 olyan replikációs origót tartalmaznak, amely a plazmid extrakromoszomális fenntartását biztosítja, néha integrálódnak a gazdasejt genomjába, általában a replikon szekvenciák ezzel együtt járó kiiktatásával. A jelen találmány így nem korlátozódik sem az alkalma- 60 zott vektor-típusra, hogy a carG gént bevezessük a cél 7
