203578. lajstromszámú szabadalom • Eljárás Streptomycesben és más organizmusokban alkalmazható carG karbomicin bioszintetikus gén előállítására
1 HU 203 578 B 2 gazdasejtbe, sem a carO gén elhelyezésére, amikor a bevezetés megtörténik. A jelen találmány szerinti vektorok tartalmaznak egy Streptomyces replikációs origót és egy carG gént tartalmazó restrikciós fragmentumot. Mivel a plazmidok sokszorozása és manipulációja gyorsabb és hatékonyabb E. coli-ban, mint Streptomycesben, kényelmes eljárás olyan DNS szekvenciákat hozzáadni, amelyek lehetővé teszik a replikádét E. coli-ban. így E. coli plazmidokból származó funkcionális replikációs origót tartalmazó és antibiotikum rezisztenciát átadó restrikciós fragmentumok nagymértékben előnyösek, és hozzájárulnak a jelen találmányt bemutató vektorok általános hasznosságához, a fenti plazmidokra példák a pUC8, pUC18, pUC19, pBR322, pACYC184, pBR325, pBR328 és hasonlók. A Streptomyces thermotolerans két karbomicin rezisztencia átadó gént tartalmaz, amelyeket carA-nak, illetve carB-nek nevezünk. Ez a két karbomicin rezisztencia gén működhet összhangban, így magasszintű rezisztenciát idézve elő karbomicinre Streptomyces thermotoleransban, így ezek előnyösek lehetnek a jelen találmány szerinti vektorként alkalmazva. A carA gént a pOJ158 plazmidból lehet izolálni, amely S. griseofuscus gazdasejtben az NRRL-nél rendelkezésre áll NRRL18090 letéti számon. A jelen találmány foglalkozik olyan vektorokkal is, amelyek tartalmazzák a carG gént és a carA és carB gén egyikét, vagy mindkettőt. A pOJ171 plazmid pl. tartalmazza mind a carG, mind a carB géneket. A jelen találmány szerinti klónozó vektorok és transzformánsok a gének olyan jellegű klónozásához valók, amely növeli a különböző termékek kitermelését, amelyek Streptomycesben és rokon sejtekben képződnek. Az üyen termékekre — nem korlátozó jelleggel —példák a karbomicin, streptomicin, tilozin, cefalosporinok aktaplanin, narazin, monezin, tobramicin, eritromicin és hasonlók. A jelen találmány szelektálható vektorokat is nyújt, amelyek alkalmasak sokféle hasznos DNS szekvencia klónozásához, jellemzéséhez és helyreállításához. A Streptomycest sokféle módon lehet tenyészteni, sokféle különböző tápközeg bármelyikét alkalmazva. Előnyös szénhidrátforrások a tápközegben lehetnek pl. a melasz, glükóz, dextrin és glicerin. Nitrogénforrások lehetnek pl. a szójaliszt, aminosav-keverékek, és peptonok. A tápközegbe szervetlen sókat is be kell építeni, ezek lehetnek pl. az olyan, kereskeddmi forgalomban levő sók, amdyek nátrium, kálium, ammónium, kalcium, foszfát, klorid, szulfát, és hasonló ionok termelésére képesek. Amint ez szükséges más mikroorganizmusok növekedéséhez és fejlődéséhez is, esszenciális nyomdemeket is adunk a tápközeghez. Az ilyen nyomdemek általában adódnak a tápközeg többi alkotórészének véletlenszerű szennyeződéséből. A Streptomyces aerob tenyésztési körülmények között nő, viszonylag széles pH tartományban, mintegy 5 és 9 között, 15*-40 *C közti hőmérséklettartományban. A plazmid stabilitásához és fenntartásához kívánatos mintegy pH 7,2 értékű tenyésztő tápközeggel kezdeni, és a tenyészet hőmérsékletét mintegy 30 ’Cion tartani. Az alábbi példák tovább illusztrálják és részletesen leírják az itt bemutatott találmányt. A találmány oltalmi köre nem korlátozódik az alábbi példák egyikére sem; a reagensek vagy berendezések forrásait csak kényelmi szempontok miatt adjuk meg, és semmiképpen sem korlátozás céljából. Mind a találmány megalkotásához szükséges magyarázatokat, mind a szükséges eljárásokat leírjuk, ahol szükséges. l.példa A pOJ171 plazmid izolálása A Az E. coli KI 2 SF8/pOJ171 tenyésztése A pOJ171 plazmidot a Northern Regional Research Center-tői szerezhetjük be. E. coli K12 SF8/pOJ 171 liofüezett tenyészetét L-agar lemezre helyezzük (10 g Bacto-tripton, 10 g NaCl, 5 g Bactoélesztőkivonat, és 15 g agar literenként), amely még 200 pg/ml apramicint is tartalmaz, üyen módon kapjuk a törzs egy egyedi telepizolátumát. Ezt a tdepet alkalmazzuk mintegy 500 ml 200 p.g/ml apramicint is tartalmazó L-tápközeg inokulálására (L-agar agar nélkül), az így létrejött tenyészetet 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk levegőztetés mellett, amíg a sejtek elérik a stacionárius fázist. A sejtekből plazmid DNS-t nyerünk ki a pOJ325 plazmid megalkotásához való felhasználásra az alábbi djárás szerint, amely eljárást Maniatis és társai munkája alapján dolgoztunk ki [Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory) 1982]. Ugyanezt az eljárást alkalmazzuk, csak kisebb lépésekben és az ultracentrifugálási lépés helyett fenolos, majd kloroformos extrahálást alkalmazva, a plazmid DNS előáüítására akkor is, amikor az E. coli KI 2 RRlAM15/pOJ325 transzformánsok azonosítására alkalmazzuk. Mintegy 500 ml stacionárius fázisban levő E. coli/pJ171 sejtet nyerünk ki 4000 g értéknél, 10 percen át, 4 *C hőmérsékleten végzett centrifugálással, és a fdülúszót elöntjük. A sejtüledéket 100 ml jéghideg STE pufferban mossuk [0,1 mól/1 NaCl, 10 mmól/1 trisz-HQ (pH 7,8) és 1 mmól/1 EDTA]. A sejtüledék mosása után a sejtüledéket újra szuszpendáljuk 10 ml 1. oldatban50 mmól/1 glükóz, 25 mmól/1 trisz-HQ (pH 8,0), és 10 mmól/1 EDTA [], amely 1 mg/ml lizozimot is tartalmaz, és 10 percen át szobahőmérsékleten tartjuk. 20 ml 2. oldatot (0,2 n NaOH és 11% SDS) adunk ezután a lizozimmal kezelt sejtekhez, és az oldatot enyhén keverjük megforgatással. A keveréket jégen inkubáljuk 10 percen át. 15 ml jéghideg, 3 mól/l-es nátrium-acetát oldatot (pH 4,8) adunk a lizált sejtkeverékhez, és az oldatot enyhén keverjük megforgatással. Az oldatot jégen inkubáljuk 60 percen át. A 3 mól/l-es nátrium-acetát oldatot úgy készítjük, hogy összekeverünk azonos térfogatú 3 mól/1 ecetsavat és 3 mól/1 nátrium-acetátot. A lizált sejtkeveréket Beckman SW27 rotorban (vagy ezzel egyenértékű berendezésben) centrifugáljuk 20000 fordulat/percnél, 20 percen át 4 *C hőmér-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 8
