203578. lajstromszámú szabadalom • Eljárás Streptomycesben és más organizmusokban alkalmazható carG karbomicin bioszintetikus gén előállítására
1 Hü 203 578 B 2 V Táblázat Poliéter antibiotikum-termelő organizmusok Organizmus Antibiotikum Actinomadura különböző fajok különböző poliéterek oligosporus A80190 Dactylosporangium különböző fajok különböző poliéterek Nocardia különböző fajok különböző poliéterek Streptomyces albus A204, A28695A és B, és szalinomicin aureofaciens narazin bobili A80438 cacaoi var. asoensis lizocellin chartreusis A23187 cinnamonensis monenzin conglobatus ionomicin eurocidicus var. asterocidicus laidlomicin flaveolus CP38936 gallinarius RP30504 griseus grisonxin hygroscopicus A218, emericid, DE3936, A120A, A28695A és B, eteromicin és dianemicin lasilaensis lazalocid longwoodensis lizocellin mutabilis S-l1743a pacaim A80438 ribosidificus Ionomicin violaceoniger nigericin Streptoverticillium különböző fajok különböző poliéterek A jelen találmányt illusztráló vektorokat Streptomyces thermotolerans NRRL 15270-be vezetjük be abból a célból, hogy példát nyújtsunk a carG gén alkalmazására egy organizmus karbomicin-termelő képességének növelésére. A S. thermotolerans NRRL 15270 a S. thermotolerans ATCC 11416-ból szárma- 40 zik mutagenezissel, amint ezt a 4 552 919 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás bemutatja. Az NRRL 15270 nem termel karbomicint, mivel a kromoszóma carG területében egy kiiktatás (deléció) van. Ez a kiiktatás mintegy 6 kb méretű, 45 amely azt jelzi, hogy a jelen találmány szerinti -14 kbs, carG-t tartalmazó restrikciós fragmentumot méretben le lehet csökkenteni, hogy még adjon át carG aktivitást. Amikor a jelen találmány szerinti carG gént tartalmazó vektorokat alkalmazzuk NRRL 15270 50 transzformálására, az így létrejövő transzformánsok több karbomicint termelnek, mint a S. thermotolerans ATCC 11416. A S. thermotolerans NRRL 15270 transzformálását és az így létrejövő transzformánsok összehasonlítását S. thermotolerans ATCC 11416-tal 65 a 3. és 4. példákban mutatjuk be. A carG gén különösen a Streptomyces thermotoleransban működik jól. Még ha az eredeti carG gén nem is fejeződik ki egy adott organizmusban, pl. E. coliban, mivel pl. a Streptomyces promoter nem képes működ- 60 ni ebben az organizmusban, a jelen találmány szerinti carG kódoló szekvenciát ligálni lehet egy megfelelő promotort és riboszóma-kötő helyet tartalmazó DNS- be, hogy a carG gén kifejeződését elérjük a kiválasztott gazdaszervezetben. A pOJ 171 plazmid tartalmazza a carG gént: (1) egy promotort, amely irányítja a fehérje-kódoló szekvenciát; (2) egy olyan szekbenciát, amely — amikor mRNS-be át van írva — irányítja az átirat transzlációját; (3) egy fehérje-kódoló szekvenciát; és (4) egy átírási terminátort. Ezeknek az elemeknek mindegyike függetlenül alkalmazható, és ezeket — a rekombináns DNS technológia révén — alkalmazni lehet nagyon sokféle rekombináns gén képzésére. Mivel a carG gén DNS szekvenciája meghatározza a carG kódoló szekvencia helyét, meghatározza más promotorok elhelyezhetőségét is a carG kódoló szekvenciával leolvasó fázisban. Ilyen más promotorok lehetnek pl: az E. coli trp, lpp és lac promoter jai, a hibrid tac promoter jai, a hibrid tac promotor, a Bacillus vég promotorja. A megfelelő promoter kiválasztásával lehet olyan vektorokat alkotni, amelyek előreviszik a carG géntennék kifejeződését bármüyen gazdasejtben. A carG gén promotorja saját működése szerint alkalmas. A carG gén promotorját és más szabályozó elemeit össze lehet kapcsolni egy nem-karbomicin antibiotikum bioszin6
