203565. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kis molekulatömegű heparin, heparán-szulfát, dermatán-szulfát és sóik, valamint ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 203 565 B 2 I. táblázat ChS és ChSpoliS biológiai aktivitásai és kémiai jellemzői USP/mg(7) APTT/mg(3) U-AXa/mg (4) LPL-Ru/mg(5) eg-SoJVeg-COO' (6) Ch(l) 0,29 0,35 U 0,1 1,0 ChSpoliS(2) 3,6 4,4 17 30 2,9 1. Természetes előfordulású kondroitin-szulfát. 2. A 870 094 számú német szabadalmi leírás szerint előállított, a 2 089 232 A számú nagy-britanniai szabadalmi bejelentés 1. példájának nyersanyagaként alkalmazott nyers kondroitin-poliszulfát. 3. Aktivált parciális tromboplasztin idő [az angol Activated Partial Thromboplastin Time kifejezés rövidítése, lásd a D. Pasu és munkatársai, N. England J. Med. 287,324 (1972) szakirodalmi helyen. „U" jelentése itt és a továbbiakban is egység]. 4. Anti Xa aktivitás [lásd az AN. Teien és munkatásai lhromb.Res., 8,413 (1976) szakirodalmi helyen]. 5. Lipoprotein lipázt felszabadító egységek [az angol „LipoProteinLipase-Releasing Units" kifejezés rövidítése, lásd a P. Bianchini és munkatársai, Arzneim. Forsch., 35, (13), 8, 1215 (1985) szakirodalmi helyen]. 6. Az -S03' csoportok aránya a -COO' csoportokhoz a diszacharid egységben potenciometrikus eljárással meghatározva [lásd a G. Mascellani és munkatársai, D Farmaco Ed., 43, 165 (1988) szakirodalmi helyen]. 7. Antikoaguláns aktivitásA depolimerizációs eljárásban a természetes kondroitin-szulfát (ChS) nem viselkedik azonos módon a kondroitin-szulfát-poliszulfáttal (ChSpoliS), ezt a későbbiekben szereplő 2-4. összehasonlító példákban mutatjuk be. Az említett példákból is látható, hogy ha szakember a kondroitin-poliszulfát 2 098 232 A számú nagy-britanniai szabadalmi bejelentésben leírt oxidativ depolimerizálásának eredményeit ismerve a jelen találmány szerinti eljárást természetes kondroitin-szulfát kiindulási anyag depolimerizálására használná, minden aktivitást nélkülöző terméket nyerne, jelentéktelen, mintegy 4,1%-os hozammal; az anyag többi része degradációs melléktermék (ezt közelebbről az 1. őszszehasonlító példában mutatjuk be). Szakember számára sem volt várható, hogy az eljárás kondroitin-szulfát vagy más természetes poliszacharidok esetén használható. Hasonló módon nem volt előrelátható a szulfátcsoportoknak a depolimerizációs reakcióban betöltött szerepe sem. A találmány szerinti gyökös depolimerizációs eljárást heparin és dermatán-szulfát kiindulási anyagokkal alkalmazva nem várt módon igen aktív, alacsony molekulatömegű antitrombotikus fragmentumokat nyerünk. A természetes kondroitin-szulfát, még ha közelítőleg hasonló is a heparinhoz, a találmány szerinti gyökös depolimerizálási eljárás során biológiailag inaktív bomlásterméket eredményez, amint az az 1. összehasonlító példában látható. A kondroitin-szulfát-poliszulfát nagyjából depolimerizálható a találmány szerinti gyökös polimerizálási eljárással. A kondroitin-szulfát szerkezetébe véletlenszerűen bevitt -S03' csoportok jelenléte (a térbeli gátlás és/vagy elektronhatás révén) védi a vegyületet a peroxid-gyökös bomlástól. A kondroitin-szulfát-poliszulfát biológiailag különbözik a természetes előfordulású kondroitin-szulfáttól. A két anyag lényegesen eltérő szerkezetét igazolja a 13C-NMR spektrum is. A 2 098 232 A számú nagy-britanniai szabadalmi 20 bejelentés alapján nem volt várható, hogy a heparint, heparán-szulfátot és dermatán-szulfátot hasonlóan depolimerizálva a kapott alacsony molekulatömegű heparin és az alacsony molekulatömegű dermatánszulfát fragmentumok biológiai aktivitással és egyéb 25 kedvező jellemzőkkel rendelkeznek. A leírás későbbi részében ismertetjük a kiindulási és a kapott termékek jellemzőinek összehasonlítását. Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy a heparin, a heparán-szulfát, a dermatán-szulfát típusú polisza- 30 charidok mgé 15 tömeg%-nál töményebb oldatban is depolimerizálhatók 20-70 ”C hőmérsékleten néhány óra alatt gyökös reakcióban, így például OH-gyök iniciálta reakcióban, persav vagy peroxid, így perecetsav, hidrogén-peroxid, 3-klór-perbenzoesav, kumén-hid- 35 rogén-peroxid, Na-perszulfát, benzoil-peroxid vizes oldatában 0,1-0,001 mól/1 fémkatalizátor jelenlétében, így Cu++ vagy Fe++ jelenlétében. A találmány tárgya szerinti eljárás előnyei a már ismert módszerekkel szemben, hogy a reakció gyorsan 40 lezajlik, a poliszacharidot a kívánt átlagos molekulatömeggel állíthatjuk elő, az eljárás műveleteit nagy mértékben is elvégezhetjük, miközben a depolimerizálandó biopolimer nagy koncentrációban van jelen, így a depolimerizált termék kinyeréséhez nem szüksé- 45 ges utólagos, költséges töményítés és tisztítás. A keletkezett oligoszacharidok lényegében tiszták, mivel a peroxid átalakulási termékeket könnyen eltávolíthatjuk és a fémkatalizátort EDTA-val vagy gyantákkal, így például imino-diacetát-csoportot tartal- 50 mazó gyantákkal elválaszthatjuk. Más szennyező anyag nem lehet jelen a reakcióelegyben, míg ettől eltérően aszkorbinsawal végzett depolimerizáláskor a reakcióelegyben debidroaszkorbinsav, diketoglutársav, treonsav és oxálsav (Nieder- 55 meier W. és mtsai, B. I. A., 141,336,1967), depolimerizált poliszacharid lehetséges szennyezői. A jelen depolimerizálási eljárással kapott kis molekulatömegö termékeket a reakcióközegből közvetlenül izolálhatjuk, főként nátriumsó formában körülbe- 60 lül semleges pH-tartományban, nem oldószerként 3
