203565. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kis molekulatömegű heparin, heparán-szulfát, dermatán-szulfát és sóik, valamint ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 203 565 B 2 A találmány tárgya eljárás 1700-8000 dalton molekulatömegű heparin, heparán-szulfát, dermatán-szulf át és ezek alkálifém- és alkáliföldfém sóinak előállítására a megfelelő természetes poliszacharidok kémiai depolimerizálásával. A találmány tárgya továbbá eljárás az ezeket a hatóanyagokat tartalmazó gyógyszerkészítmények előálltására. A találmány szerinti eljárással előállított termékek jelentős mértékben gátolják azXa faktort, kiemelkedő az antitrombotikus hatásuk, alig vagy egyáltalán nem fejtenek ki koagulálásgátló hatást, jelentős a fibrinolitikus és a gyulladásgátló hatásuk. Ezek a termékek orális alkalmazásával biológiailag jói felhasználhatók, mivel — összehasonlítva a kiindulási poliszacharidokkal — az oligomerek molekulatömege alacsony. A találmány tárgya poliszacharidok depolimerizálása, amit előnyösen 5-20%-os, még előnyösebben 5- 15%-os vizes oldatban, 30-70 *C hőmérsékleten, peroxiddal vagy persavval, így hidrogén-peroxiddal, perecetsawal, 3-klór-perbenzoesawal, nátrium-perszulfáttal, kumil-hidrogén-peroxiddal iniciált gyökös reakcióban, 0,001-0,1 mól/1 katalitikus mennyiségű fém, így Cu++ vagy Fe++ jelenlétében végzünk. A depolimerizált terméket rendszerint oldószerrel vagy kvaterner ammonium bázissal kicsapva szilárd halmazállapotban választjuk el a reakcióoldatból. A keletkezett oligoszacharidot rendszerint sóvá alakítjuk. Ezt végezhetjük alkálifémmel, így nátriummal, káliummal vagy lítiummal vagy alkáliföldfémmel, így kalciummal vagy magnéziummal. A Ids molekulatömegű heparin, így a 3500-8000 daltonos heparin jelentős antitrombotikus hatású, amely nem jár együtt koagulálást gátló hatással vagy csak kis mértékű Uyen hatással rendelkezik. A legalább 12-14 cukormaradékot tartalmazó dermatán-szulfát fragmensek, amelyek perjódsavas degradálással (Tollefesen DM. Nouv. Rev. Fr. Haematol., 26, 233, 1984) és affinításkromatográfiás oszlopon való frakcionálással nyerhetők a irodalom szerint jelentős hatást fejtenek ki a heparin n. kofaktorra, és ez az aktivitás nagyobb, mint amely a nemfrakcionált dermatán-szulfátoknál tapasztalható. Egyéb kondroitin-szulfátoknak és heparán-szulfátoknak nincs ismert depolimerizációs terméke. A természetes heparin depolimerizálására különféle eljárásokat írnak le a szakirodalomban. Az egyik Ids molekulatömegű tennék előállítására alkalmas egyik eljárás lényege salétromsav híg oldatában a heparin dezaminálásos hidrolízise. A keletkezett (I) általános képletű vegyületekre jellemző a 2,5-anhidro-mannóz terminális maradék (4 438 261 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, WO 82/03627 számú 1982. 10. 28-án publikált, és a 00 48 231. számú közzétett európai szabadalmi bejelentés. Egy másik eljárásban heparint (00 40 144. számú közzétett európai szabadalmi bejelentés vagy a heparin ftlldl- vagy aril-észterét (00 44 288. számú közzétett európai szabadalmi bejelentés) alkálikusan hidrolizálják, így ß-eliminálással oligomereket kapnak, amelyek molekulatömege 2000-9000 dalton, és amelyek terminális csoportként (Q) általános képletű telítetlen cukrot tartalmaznak. A képletben R’ jelentése H vagy -S03H csoport, R jelentése — COOH csoport. A terméket igen alacsony kitermeléssel állítják elő. Egy másik depolimerizálási eljárásban erősen hígított oldatban a heparint heparinázzal enzimesen hidrolizálják, és nagyon alacsony kitermeléssel kapják meg a terméket, amelynek terminális csoportja a (ül) általános képletű cukor és a glükózamin (IV) általános képletű hemiacetál formája (00 64 452 számú európai szabadalmi leírás J. Bioi. Chem. 257,7310,1982). A heparin depolimerizálására egy másik eljárás szerint oxidálószert, így alkáli-perjodátot alkalmaznak, hogy a szulfátmentes uronsav C2-C3-hidroxücsoportja közötti kötést oxidálják, majd a glüközidkötést bontják (Case B. „Structure and Biological Activity of Heparin”, Advances in Carbohydr. Chem. Biochem, 43.kötet, 1985,51-134., Acad. Press). Egy további eljárás a hidrogén-peroxid és a savas pH heparinra kifejtett kombinált hatásán alapul. Az eljárás magas hőmérsékleten (125 *Q és nyomáson zajlik. A depolimerizáció következtében az oligomer aktivitása megváltozik, esetleg jelentősen csökken (a 0101141 számú európai szabadalom). Egy még további eljárásban kénsavval savas depolimerizálást végeznek, és egyidejűleg vagy ezt követően klór-szulfonsawal reszulfatálnak (Nagasawa K. és munkatársai, Archiv. Biochem., Biophys., 150, 451, 1972, és a 2 538 404 számú francia szabadalmi leírás). Mindezek az eljárások laboratóriumi méretekben zajlanak és jellemzőjük az alacsony kitermelés és gyenge reprodukálhatóság, különösen érvényes ez félüzemi vagy üzemi léptékű méretnövelés esetén. A 012 1067. számú európai szabadalmi bejelentésnek megfelelő 40021 A/83 közzétételi számú olasz szabadalmi bejelentésben olyan eljárást közölnek, amelyben egyidejűleg hidrogén-peroxidot, aszkorbinsavat és réz(H)-acetátot alkalmaznak megfelelő molekulatömegű oligoszacharidok előállítására. Ez az eljárás hosszú idő alatt, így 24-48 óra alatt, és erősen hígított heparinoldattal alacsony kitermeléssel zajlik. Ezenfelül a depolimerizált termék az aszkorbinsav degradálási termékei szennyezett. A 2 098 232 számú közzétett nagy-britanniai szabadalmi bejelentésben egy nem természetes kondroitin-szulfát depolimerizálását írják le hidrogén-peroxid Cu2+ jelenlétében való alkalmazásával. A természetes kondroitin-szulfát (Chs) különbözik a kondroitin-szulfát mesterségesen létrehozott poliszulfátjától (ChSpoliS), amint az az alábbi, a ChS és ChSpoliS biológiai aktivitását és kémiai jellemzőit bemutató I. táblázatból kiviláglik. 6 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 2
