203373. lajstromszámú szabadalom • Eljárás HIV-ellenes aktivitással rendelkező heparin előállítására
11 HU 203 373 B 12 át sós-jeges fürdőben -3 *C-on 5% anizolt tartalmazó folyékony hidiogén-fluoriddal (HF) kezeljük. A HF-t vákuumban eltávolítjuk, és a pepiidet 30%-os ecetsavval, majd 30%-os acetonitríllel extraháljuk a gyantáról. A szűrleteket liofilizáljuk és a maradékot 6M karbamid oldatban oldjuk. A pepiidet Beckman C18 oszlopon (5 cm x 150 mm) tisztítjuk, 80 ml/perc áramlási sebesség mellett, 15 pácén át, 20-25%-os lineáris acetonitril-grádienssel 0,1 %-os trífluor-ecetsavban. A fő csúcsot elkülönítjük és liofilizáljuk. 137,9 mg keresett terméket kapunk. Az aminosav-elemzés eredménye (6 N HG, 48 óra, 106 ‘Q: Asx 1,79(2), Thr 1,98(2), Ser 0,81(1), Glx 0,98(1), Pro 0,94(1), Gly 4,14(4), Alá 1,01(1), Val 1,09(1), Ile 3,85(4), Phe 0,98(1), Lys 2,07(2), Aig 3,75(4); FAB-MS (M+M)*: 2640,1 ± 1 m.u. (számított MT = = 2638,5). 2. példa Az AffiGel- 10-hez kötött RP135 peptid előállítása 10 ml AffiGel-10-hez (BioRad) 0,1 M pH 6,0- 10,0 MOPS kapcsoló pufferben hozzáadunk 100- 300 mg RP135-öt, kapcsoló pufferben oldva. A kapcsolási reakciót 4 ‘C-on végezzük, enyhe rázatás közben, 4 órán át. A gyantán maradó aktív észtereket oly módon blokkoljuk, hoy 1 ml gélre számítva 0,1 ml 1 M pH 8 glicin-etil-észter oldatot vagy 0,1 ml 1 M pH 8 etanol-amin-klórhidrát oldatot adagolunk, majd a rendszert 1 órán át inkubáljuk. A gyantát ezután egy oszlopba töltjük és alaposan mossuk 0,01 M Hepes pufferrel (pH 7,4; 0,05 M NaCl). 3. példa A HIV-ellenes heparin elkülönítése affinitáskromatográíiával, AffiGel- 10-hez kötött RP135 peptid felhasználásával A kereskedelemben kapható heparin-készítmény RP135-Affi-Gel-10-zel végzett frakcionálását az 1. ábra mutatja be. A peptidoszlop a teljes heparin-mennyiségnek kb. 2%-át (az uronsav és a száraz tömeg alapján meghatározva) tartja vissza. Az eluálást 1 M NaQ oldattal végezzük. Az így kapott HIV-elleni aktivitású heparin, fizikai-kémiai adatai megegyeznek a kiindulási heparin megfelelő azonosítási adataival. A meg nem kötött heparin (URH5) öt egymás utáni áteresztése a megkötött vagy magas reakcióképességű heparin (HRH) mennyiségének csökkentését eredményezi úgy, hogy az ötödik átengedés után HRH nem mutatható ki. Egy kontrolioszlopon, amelyet úgy készítettünk el, hogy etanol-amint kapcsoltunk AffiGel- 10-hez, nem volt megfigyelhető a heparin megkötése. Az 1. ábrán szereplő betétábra azt mutatja be, hogy a CD-elemzés eredményei alapján a HRH növeli a PR 135 rendezett szerkezetét (17% alfa-helix, 43% beta-helix, 40% statisztikus elrendeződésű csavar). Az oldatban lévő RP135 túlnyomóan véletlenszerű szerkezetű (17% alfa-helix, 13% beta-helix, 70% statisztikus elrendeződésű csavar). így megállapítható, hogy a heparinhoz kötődve az RP135 peptid-konformációja változáson megy át, amely a specifikus kölcsönhatásra jellemző. Ezek az észleletek arra mutatnak, hogy az RP135 iránt legmagasabb affinitást mutató heparinfrakció elkülönült a nyers kereskedelmi heparinkészítményből. Az a körülmény,hogy a nyers heparin nem kötődik az etanolamin-AffiGel- 10-hez és a peptid-oszlopon végzett egymás utáni kromatografálás során elveszti a HRH-t, arra mutat, hogy szelektív kölcsönhatás megy végbe: az RP135 specifikusan frakcionálja a heparint. így levonható az a következtetés, hogy az RP135 által képviselt szekvenciaagpl20-ban megköti a glikóz-amino-glikánokat. 1. táblázat A gpl20 feltételezett heparinkötő szakaszai gpl20-I65I ST SKRGKVQKE YAFFYK gpl20 - “‘N N N T R K S I R I QRGPGRAF (RP-135) gpl20-477S ELY KYKV VK IE P LGVAP gpl20-494P TKA KRR V VQRE KR AVGI A gp41 feltételezett heparinkötő szakaszai gp41 -227GERD RDRS I R LV NG S L AL gp41-271VEL LGRRG WEAL KYWWNL gp41 -325AYR A I RHIPRRI RQGLER Az I.táblázatagpl20ésagp41 további feltételezhető heparinkötő szakaszait mutatja be, amelyek a glikózamino-glikánok és más szulfatált poliszacharidek megkötésekor funkcionálnak. Ezek a területek nagy pozitív töltéssűrűséget mutatnak; ez a heparinkötés esetében aktuális két egyezményes szekvencia-típusnak; X-By-X-B-X és X-Bj-Xr-B-X, ahol B és X bázisos, ill. töltés nélküli csoportnak felel meg. Ezt korábban A. D. Cardin és H. J. R. Weintraub határozta meg (Arteriosclerosis, Vol. 9, p. 21-22., 1989). Az ezeknek a területeknek megfelelő szintetikus peptidek valószínűleg - az RP135-höz hasonlóan - alkalmazhatók a szulfatált poliszacharidok frakcionálására. így fokozott gátló hatás érhető el a HTV-vel szemben. A 2. táblázat a vitronektin heparinkötő tartományát és e vegyület szekvenciájának az RP135-éhez való hasonlóságát mutatja be. Következésképp az AffiGel-hez kapcsolt vitronektin szintén felhasználható heparin vagy más szulfatált poliszacharid frakciók előállítására, amelyek magas affinitást mutatnak a gpl20/gp41 iránt és amelyek HIV-ellenes aktivitása magasabb. 4. példa A HIV-ellenes heparin szincitium-képződést megelőző képessége és a P24 vírus-mag antigén kifejeződése JM sejtek és GB8 vírustörzs alkalmazása esetén Annak kimutatására, hogy az RP135-höz kötődő heparin blokkolja a HIV-fertőzést, CD4+ T-sejteket (JM) a HIV-1 egy klinikailag izolált törzse - GB8 (24) - hatásának teszünk ki. A vírust először HRH-val inkubáljuk 15 percen át, majd hozzáadjuk a sejteket. 2 órás adszorpció után a vírus-inokulumot eltávolítjuk és a sejteket háromszor mossuk, a bevitt vírus nyomainak eltávolítására. A vírusellenes hatást 3 napi inkubálás után határoz-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
