203373. lajstromszámú szabadalom • Eljárás HIV-ellenes aktivitással rendelkező heparin előállítására
13 HU 203 373 B 14 2. táblázat RP135; a gpl20 heparinkötő tartományának feltételezhető, a vitronektin heparinkötő tartományához hasonló szekvenciája [X-B-B-B-X-X-B-X]* RP-135 VITRO-nekun” 307N N T R 353H R N R V T I G K I G N Q N S R R P * A heparinkötés egyezményes szekvenciája, amelyben B egy bázisos maradék előfordulásának valószínűsége és X egy töltés nélküli maradék. b A vitronektin heparinkötő szekvenciája, Suzuki et al. szerint (Embo J. 4, p. 2519, 1985). A körülrajzolt területek szerkezeti hasonlóságokra mutatnak. A tulajdonságok megőrzése mellett végbemenő helyettesítéseket maradékpárokkal jelezzük, amelyek a következő csoportokba sorolhatók: S.T.A.GJ*; N,D,E,Q; R,K,H; M,I,L,V; F,Y,W. zuk meg oly módon, hogy a négy párhuzamos kísérletben talált szincitiumok számának átlagát felvesszük a szulfátéit poliszacharid koncentrációjának log10 értékével szemben. Azt találtuk (2A. ábra), hogy a HRH 50%-os hatásos 5 dózisa (ED») a szicitium-képződés gátlása vonatkozásában 03 p/ml. Ez az érték összehasonlítható az URH, 22 |ig/ml-es és a dextrán-szulfát (M^oo,ooo) 13 pg/ml-es értékével (2A. ábra). A HRH, az URHS és a dextrán-szulfát potenciáját oly 10 módon is mérjük, hogy meghatározzuk a vírus-mag antigén (P24, Abbott teszt) mennyiségét a felülúszó folyadékban (2B. ábra). A HRH, URH, és a dextrán-szulfát kapott EDM értékei: 0,4; 3,0 és 2,0 p/ml; ez a sorrend azonos azzal, amelyet a szincitium-képződési 15 vizsgálattal határoztunk meg. További kísérletek arra mutatnak, hogy az RP135 iránt affinitást mutató heparin antivirális aktivitása következetesen tízszerese a nem kötött frakciókénak és minden esetben nagyobb, mint a nagy molekulatömegű dextrán-szulfáttal elérhető. 5. példa A HIV-ellenes heparin képessége a szinciúum-képződés teljes blokkolására 10 jig/ml koncentrációban, JM 25 sejtek és GB8 vírustörzs alluűmazása mellett A 3 A és a 3B ábra fertőzött sejtek fényképfelvételeit mutatja be, amelyeket 10pg/ml heparin távollétében, ill. jelenlétében tenyésztünk, ez a koncentráció teljes védelmet nyújt a szincitium-képződés ellen. 6. példa A HIV-ellenes heparin képessége a P24 vírus-mag antigén kifejeződésének megakadályozására különböző vírustörzsek (GB8, RF és IBB) és sejtek (JM és C8166) 35 alkalmazása mellett A HIV-ellenes heparin (HRH) védő hatását más kísérletekben is igazoltuk, amelyeket a C8166 T-sejtvonal alkalmazásával végeztünk; ezt a HIV-1 prototípus törzzsel, az RF törzzsel vagy HTLV-IIIB-vel fertőztük 40 meg. A legmagasabb HIV-ellenes hatást a HRH mutatja (4A-C. ábra). A HRH, az URH5 és a dextrán-szulfát ezekre a sejtekre nézve 100 fig/ml koncentrációban még nem toxikus, amint ez a tetrazólium-redukciós vizsgá- 45 lattal meghatározható. A HRH azonban magasabb antikoaguláns hatást mutat, mint az URH5 és a dextrán-szulfát. 10 pg/ml koncentrációban a HRH, URH, és a nemfrakcionált heparin által kiváltott alvadási idők 2,4-szeresre, 1,5-szeresre, ill. 1,9-szeresre növekedtek ahhoz a plazmához képest, amelyet a HTV-aktivitás meghatározásához kontrollként használtunk. 3. táblázat Különöző heparin frakciók antikoaguláns tulajdonságai Minta Heparin tömeg* Alvadási idó (szék.) kontroll 15,8 ± 0,3 (n=8 ) HRI? 920 37,1 ± 2,7 (n=10) 460 20,0 ± 0,4 (n=8) 180 17,3 ± 0,3 (n=8) URH, 920 23,5 ± 0,7 (n= 10) nyers heparin 920 29,4 ± 0,9 (n= 10) * ng heparin (szárazanyag) / 100 pl plazma dimenzióban b nyers heparin RP135-AffiGel-10-en végzett frakcionálással tisztítva 0,4 pg/ml koncentrációban /azaz az ED» értéken) a HRH kismértékű kimulatható alvadásgátló aktivitást 30 mutat (nem tüntetjük fel). A HRH HIV-1 ellenes potenciáját tekintve (ED50 0,35 pg/ml-nél kisebb vagy azzal egyenlő) lehetséges lenne a heparin in vivo olyan koncentrációkban való bevitele, amelyek minimális alvadásgátló hatást eredményeznek jelentős HIV-1 ellenes aktivitás mellett. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás HIV-ellenes aktivitású heparin előállítására, azzal jellemezve, hogy i) a heparint gyantán rögzített RP135 pepiidhez kapcsoljuk, ii) a gyantához kötött RP135 pepiidet a hozzá kapcsolódon HIV-ellenes aktivitású heparinnal együtt elválasztjuk a heparin tói, 8
