203373. lajstromszámú szabadalom • Eljárás HIV-ellenes aktivitással rendelkező heparin előállítására
7 HU 203 373 B 8 - halogéniánnal (pl. brómciánnal); az aktivált gyantát ezután xeagáltatjuk az (1) képiéül pepiiddel, vagy (3) egy mono-epoxiddal vagy egy bisz(epoxiddal), majd a kapott aktivált gyanta reagáltatható az (I) képletű pepiiddel, vagy (4) diazotálással, majd a gyantát az (I) képletű peptiddel reagál tatjuk. Ha a gyanta karboxil-csoportot tartalmaz, közvetlenül reagáltatható az (I) képletű peptiddel, savamid képződése közben vagy a szabad karboxil-csoport kaibodiimiddel reagáltatva egy prím»' aminhoz kapcsolható. Ha a gyanta egy halogénatomot tartalmaz, közvetlenül reagáltatható az (I) képletű peptiddel; ennek során a halogénatomot egy szabad amino-, karboxil- vagy hidroxi-csoport kiszorítja a gyantából. A találmány szerinti eljárás végrehajtásában felhasználható gyanták közé tartozik számos, a kereskedelemben hozzáférhető, származékképzéssel átalakított gyanta, amely egyszerűen alkalmazható, a leírásban ismertetett technikák szerint vagy a szakember számára egyébként önmagukban ismert eljárások szerint, a találmány tárgyát képező eljárással kinyerhető, gyantához kötött peptidek előállítására. Az említett mátrixokra példák a következők: SpeharoseR (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Svédország); Affi-GelR 202, Affi-Gel-10 és -11 (Bio-Rad Inc., AEA), Eupergit (Röhm Pharma, Weiterstadt, NSZK) stb. Ezek a funkcionális származékok képesek arra, hogy közvetlenül kötődjenek az (I) képletű peptidhez. Egy, a találmány szerinti, gyantához kötött peptidben a peptid mennyisége kb. előnyösen kb. 2-300 pmól/1 g (a gyantához kötött peptid nedves alakja esetében), de lehet ennél kevesebb vagy több, a kapcsolás hatásfokától függően. A "nedves alak” kifejezés a gyantához kötött peptid nedves tömegére utal, amint azt a vizes szuszpenzió szűrése után mérjük. A frakcionálandó heparin oldat pH értéke előnyösen kb. 7-8,5. A 7-nél alacsonyabb pH-jú heparin oldatok azonban ugyancsak alkalmazhatók, legalábbis egyes esetekben, pl. epoxidok alkalmazása esetén, vagy ha a kötéseket vízoldható, karbodiimid gyantával való reagál tatással alakítjuk ki. Haaheparin-oldatotagyantához kötött peptiddel frakcionáljuk, alkalmazhatunk folyamatos eljárást (pl. oszlopot) vagy szakaszos eljárást, amikor a gyantához kötött peptidet „sarzsokban” használjuk fel. Ha pl. oszlopot alkalmazunk, úgy járunk el, hogy a gyantához kötött peptidet betöltjük az oszlopba, majd etanol-amin tartalmú oldattal mossuk a fölösleges vagy maradék gyanta (a peptidhez nem kötött funkciós csoporttá;) blokkolására. Ezt követően vizes mosást végzünk a sók eltávolítására, és puffer-oldatot adagolunk az oszlop kiegyensúlyozására, a heparin vagy más szulfatált poliszacharid peptidhez való kötése szempontjából optimális körülmények között A heparint vagy más szulfatált poliszacharidot tartalmazó oldatot átvezetjük az oszlopon és a rendszert a fent említett puffer-oldattal öblítjük át. Végül az adszorbeált heparint vagy más szulfatált poliszacharid frakciót eluálással eltávolítjuk a gyantáról. Ez pl. növekvő só-grádienssel történhet. Az így kapott szulfatált poliszacharid frakció tisztított alakban van jelen és lényegében mentes sok eredeti szennyezéstől. Ha viszont a szakaszos eljárás szerint járunk el, a heparint tartalmazó oldatot hozzáadjuk az adszorbenst tartalmazó szuszpenzióhoz. A kapott keverék pH-ját 2,5-8,5 közé (előnyösen 6,5-8,5-re) állítjuk be és kevertetjük, a szulfatált poliszacharidoknak az adszorbensre való szelektív adszorbeáltatására. A szulfatált poliszacharídokat hordozó adszorbenst kinyerjük, mossuk, majd a szulfatált poliszacharidot tiszta formában kinyerjük. A poliszacharidot a gyantáról egy magas sókoncentrációjú pufferrel - amilyen pl. a 0,2-1,0 M NaCl-oldat - választjuk le, vagy 10-nél magasabb - előnyösen 10-11,5 közötti - pH beállításával, vagy a pH csökkentésével. Az egymással érintkezésbe hozott szulfatált poliszacharíd-tartalmú oldat és az adszorbens aránya különböző paraméterektől függ, amilyenek a kővetkezők:- az oldatban levő szulfatált poliszacharid összmenynyisége,- az alkalmazott konkrét adszorbens,- a kiválasztott munkafeltételek, különösen a szulfatált poliszacharid oldat koncentrációja és- a szennyezések minősége és mennyisége. Ezek az intervallumot meghatározó műveletek azonban a szakember tevékenységi körébe tartoznak, a leírásban ismertetettek alapján. A HIV-ellenes szulfatált poliszacharid a szincitiumképződés megakadályozására használható fel a HIV-1 vírussal vagy más hasonló - gpl20 felületi fehérjét tartalmazó - vírussal fertőzött sejtekben. A HIV-ellenes szulfatált poliszacharidok felhasználhatók az AIDS, az ARC és más betegségek kezelésére, amelyeket a HIV-1 retrovirus vagy más hasonló, gpl20 felületi fehérjével rendelkező vírus okoz. A szincitium képződésének a HTV-vel fertőzött sejtekben való megakadályozására szükséges mennyiség, amelyet a HIV-ellenes szulfatált poliszacharídból veszünk, bármilyen hatásos mennyiség lehet Kísérleteink során megállapítottuk, hogy a HIV-ellenes szulfatált poliszacharid 10 pg/ml koncentrációban alkalmazva a szincitium-képződés teljes gátlását eredményezi, ezen kívül a P24 antigén szintjét (ez a vírus-replikáció indikátora) 3,0 x 102 alá csökkenti. Az AIDS, ARC vagy más, a HIV-fertőzés által okozott betegség kezelésére bevitt HIV-ellenes szulfatált poliszacharíd-mennyiség tág határok között változhat az alkalmazott konkrét dózisegység, a kezelés időtartama, a kezelendő beteg kora és neme, a kezelt betegség minősége és előrehaladottsága és más tényezők függvényében, amelyek a vonatkozó szakterületek szakemberei számára ismertek. A HIV-ellenes szulfatált poliszacharid ezen kívül alkalmazható más szerekkel együtt is, amelyekről ismert, hogy felhasználhatók a retrovirális betegségek kezelésére, ill. a retrovírusok által okozott betegségekkel, állapotokkal összefüggő komplikációk és tünetek kezelésére. A HIV-ellenes szulfatált poliszacharidnak a HÍV ellen hatásos mennyisége, amelyet be kell adagolnunk, általában a kb. 15 mg/kg - 500 mg/kg tartományba esik. Egy egységdózis 25-500 mg szulfatált poliszacharidot tartalmazhat és naponta egy vagy több alkalommal vehető be. A HIV-ellenes szulfatált poliszacharid egy gyógyászati szempontból elfogadható vivőanyaggal együtt adagolható be, a szokásos adagolási formák alkalmazásával, orálisan vagy parenterálisan. Orális bevitelhez a HIV-ellenes szulfatált poliszacharidot szilárd vagy folyékony készítményekké alakíthat5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
