203370. lajstromszámú szabadalom • Eljárás főleg nátriuretikus és diuretikus hatású peptidek és az azokat tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására

HU 203370B

4. Referencia példa

H-Aoc-Cys-Phe-D-ala-Gly-Arg-Ile-Asp-Arg- Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-GIy-Cys-Asn-Ser- Phe-Arg-Aoc-NHfe szintézise

A peptidszintézist az EP 322 348 szám alatt publikált európai szabadalmi bejelentésben leírt gyanta 1 g-jával Fmoc-aminosav-OObt-észterrel Modell 430A automata peptid szintetizáló berendezésben (Applied Biosystems termék) és saját módosított szintézis programunkkal végezzük.

A szintézisben a gyártó által adott patronokba megfelelő aminosav-származékból 1 mmól mennyiséget bemérünk, majd 1,5 mmól HOBt-vel Fmoc- Arg(Mtr)-OH-t, Fmoc-Asn-OH-t és Fmoc-Gln- OH-t mérünk be. Ezeknek az aminosavaknak az előaktiválását a patronokban végezzük 4 ml dimetilformamid oldattal, és dimetil-formamid oldattal, és dimetü-formamidban oldott 0,55 M diizopropükarbodiimid oldat 2 ml-ével. A HOObt-észtert feloldjuk 6 ml dimetil-formamidban, majd ugyanúgy, mint az in situ előaktivált aminosavakat, arginint, aszparagint és glutamint pumpálunk a dimetil-formamidban készített 20%-os piperidin-oldattal szabaddá tett gyantára. Az in situ aktivált aminosavakat duplán kapcsoljuk.

A szintézis befejezése után a peptid-amidot a gyantáról lehasítjuk, miközben egyidejűleg tio-anizolt és m-krezolt (kationfogó) tartalmazó trifluorecetsawal eltávolítjuk az oldalláncon lévő védőcsoportokat. A trifluor-ecetsavat leszívatjuk, az így kapott maradékot etil-acetáttal többször digeráljuk és centrifugáljuk. A visszamaradó nyers peptidet trifluor-etanolban tributil-foszfinnal kezeljük, így a cisztein védőcsoportokat eltávolítjuk. Az oldószert eltávolítjuk, majd a maradékot ismét etil-acetáttal digredáljuk és centrifugáljuk. A redukál t nyers peptidet rögtön 80%-os vizes ecetsavban jóddal oxidáljuk, a jód felesleget aszkorbinsawal eltávolítjuk, és a reakcióelegyet kis térfogatra bepároljuk, majd Sephadex G25-ön vizes 1 n ecetsavval sómentesítjük. A tiszta peptidet tartalmazó frakciókat összeöntjük és fagyasztva szárítjuk.

A következő vegyületeket a 2. referencia pédának megfelelően állítjuk elő.

1. H-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Ile-Asp- Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn -Ser-Tyr(Me)-Arg-Tyr-OH

2. H-Ser-Ser-Cys-Tyr(Me)-Gly-Gly-Arg-Ile- Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys -Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OH

3. H-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Ile-Asn- Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn -Ser-Phe-Arg-Tyr-OH (az 1. igénypont szerinti kizárás alá eső vegyület)

4. H-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Ile-Asp- Arg-Pro-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn -Ser-Phe-Arg-Tyr-OH (az 1. igénypont szerinti kizárás eső alá vegyület)

5. H-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Ile-Glu- Arg-Ile-Gly-Ala-Pro-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Thr- Ser-Phe-Arg-Tyr-OH

13

6. H-Cys-Phe-D-Ala-Gly-Arg-Ile-Asp-Arg- Cyclohexylalanyl-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly -Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OH

7. H-Ser-Ser-Cys-Phe-NH-(CH2)5-CO-Arg-Be- Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys -Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OH

A következő vegyületeket a 2. referencia példa alapján állítjuk elő, amikoris az első aminosavat MBHA-gyantára kapcsoljuk, és a hasítást az 1. referencia példában leírt módon hidrogén-fluoriddal vagy trifluor-metánszulfonsawal végezzük.

8. H-Aoc-Cys-Phe-D-Ala-Gly-Arg-Ile-Asp- Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn -Ser-Phe-Lys-NH2

9. H-D-Aoc-Cys-Phe-D-Ala-Gly-Arg-He-Asp- Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Gys-Asn -Ser-Phe-Lys-NH2

10. H-Aoc-Cys-Phe-D-Ala-Gly-Arg-Ile-Asp- Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn -Ser-Phe-Arg-Aoc-NH2

11. H-Aoc-Cys-Phe-D-Ala-Gly-Arg-Ile-Asp- Arg-tert.Butylglycycl-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu -Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-NH2

12. H-Aoc-Cys-Phe-D-Ala-Gly-Arg-Be-Asp- Arg-Neopentylglycyl-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu -Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-NH2

13. H-Aoc-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Ile-Asp-Arg- Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Vys-Asn-Ser -Cyclohexylalanyl-Arg-NH2

A következő vegyületeket (14-21. példa) a 3. referencia példa szerint állítjuk elő.

14. H-Cys-Phe-D-Ala-Gly-Arg-Ile-Glu-Arg- Ile-Glu-Arg-Ile-Gly-Ala-Thr-Ser-Gly-Leu-Gly- Cys-Pro-Ser-Phe-NH-(CH2)4-NH2

15. H-Aoc-Ser-Cys-Phe-Gly-Gly-Gly-Arg-Ile- Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys -Asn-Ser-Phe-NH-(CH2)8-NH2

16. H-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Ile-Asp-Arg-Ile- Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys -Asn-Ser-Phe-NH-(CH2)8-NH2

17. H-Cys-Phe-D-Ala-Gly-Arg-Ile-Asp-Arg- Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser- Phe-NH-(CH2)6-NH2

18. H-Aoc-Cys-Phe-D-Ala-Gly-Arg-Ile-Glu- Arg-Ile-Gly-Ala-Thr-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Gly- Ser-Phe-NH-(CH2)6-NH2

19. H-Arg-Cys-Phe-D-Ala-Gly-Arg-Ile-Asp- Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn -Ser-Phe-NH-(CH2)6-NH2

20. H-Arg-Arg-Cys-Phe-D-Ala-Gly-Arg-Ile- Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys -Asn-Ser-Phe-NH-(CH2)6-NH2

21. H-Aoc-Cys-Phe-D-Ala-Gly-Arg-Ile-Glu- Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Gly -D-Ala-Phe-NH-(CH2)6-NH2

A peptid jellemzését aminosav analizáló berendezéssel végezzük. A peptideket 12 órán keresztül 120 °C hőmérsékleten 6 n sósavoldattal hidrolizáljuk. A cisztein ekkor cisztein és ciszteinsav elegyeként keletkezik, és minden egyes pepiidben előfordul.

14

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

8