203369. lajstromszámú szabadalom • Eljárás enzimgátló dipeptid-karbamoil-származékok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
HU 203369B ten keverjük, majd az oldószert forgó vákuum bepárlóban eltávolítjuk. A racém A és B aminosavak alkalmazása esetén képződő sztereoizomer elegyek, így a diasztereomer elegyek ismert módon, például frakcionált kristályosítással vagy kromatográfiásan szétválaszthatok. Az új (I) általános képletű dipeptid-karbamoüszármazékok erős enzimgátló hatássd rendelkeznek, elsősorban az aszpartilproteázokat, így a renint és a vírusos proteázokat, így a HÍV proteázt gátolják. A renin az aszpartil-proteázok osztályába tatozó proteolitikus enzim, amely különböző ingerek (nagy térfogatú ürítés, nátrium-hiány, ß-receptor stimuláció) hatására a vese juxtaglomeruláris sejtjeiből a vérkeringésbe kerül. Ott a májból kivált angiotenziogénről lehasítja az angiotenzin I dekapeptidet. Ezt az „angiotensin converting enzyme” (ACE) angiotenzin II enzimmé alakítja. Az angiotenzin II fontos szereppel bír a vérnyomás szabályozásában, amivel a véredények összehúzásával közvetlenül szabályozza a vérnyomást. Emellett stimulálja az aldoszteronnak a mellékvesékből történő kiválasztását és így növeli a nátriumkiválasztás gátlásával az extra - celluláris folyadék térfogatát, amely a maga részéről szintén a vérnyomás növekedését fokozza. A renin enzimetikus aktivitásának gátlói csökkentik az angiotenzin I képzését, amelynek következménye az angiotenzin II termelés csökkenése. A renin-gátlók vérnyomáscsökkentő hatásának közvetlen oka tehát a fenti aktív peptid hormon koncentrációjának csökkentése. A renin-gátlók hatékonyságát in vitro vizsgálattal ellenőrizhetjük. Ennek során az angiotenzin I képződésének csökkenését különböző rendszerekben (humán plazma, tisztított humán renin) mérjük. A vizsgálat alapelve, hogy például a humán plazmát, amely mind renint, mind angiotenzinogént tartalmaz, 37 °C hőmérsékleten a vizsgálandó vegyülettel inkubáljuk. Ennek során az angiotenzinogénből a renin hatására angiotenzin I válik ki, amely a szokásos radioimmuno assay vizsgálattal mérhető. Arenin-gátlók ezt az angiotenzin felszabadulást gátolják. A plazma előállításához önkéntes jelentkezőktől vért veszünk (mintegy 0,5 liter fejenként, Bluko- Entnahmegerät der Fa. ASID Bonz und Sons, Unterschleissheim, NSZK) és jéghűtés közben részben légtelenített üvegekben felfogjuk. A véralvadás meggátlásához 10 mmól/1 végkoncentrációban EDTA-t adagolunk, majd a mintát 3500 fordulat/perc mellett 0-4 “C közötti hőmérsékleten 15 percen keresztül centrifugáljuk (HS 4 rotor, Sorvall), amelyet kívánt esetben megismételünk, majd a plazmát pipettával óvatosan eltávolítjuk sé megfelelő adagokban -30 °C hőmérsékleten fagyasztjuk. A vizsgálatokhoz csak a megfelelő renin-aktivitást mutató plazmát alkalmazzuk. Az alacsony renin-aktivitást mutató plazmát megfelelő kezeléssel (-4 °C hőmérsékleten tárolva 3 napon keresztül) aktiváljuk, amelynek során a proreninból renin képződik. A vizsgálatok megvalósításához az angiotenzin I mennyiségét Renin-Maia készlettel (Serono Diagnostics SA., Coinsins, Svájc) határozzuk meg. A 5 plazma inkubálását az ott megadott útmutató szerint végezzük. Az inkubáláshoz alkalmazott oldatok: 1000 pl plazma (0-4 °C hőmérsékleten felolvasztva) 100 pl foszfát puffer (pH- 7,4) (adalékanyag 10-4 mól/1 ramiprilát) 10 pi PMSF-oldat 10 pJ0,l tömeg%-os Genapol PFIC 12 pd dimetü-szulfoxid, illetve tesztkészítmény. A tesztkészítményt 10’2 mól/1 koncentrációban 100 tömeg%-os dimetil-szulfoxidban oldjuk és dimetil-szulfoxiddal a kívánt koncentrációra hígítjuk. Az inkubáláshoz alkalmazott oldat legfeljebb 1 tömeg% dimetü-szufloxidot tartalmazhat. Az oldatokat jégen hűtve összekeverjük és egy órán keresztül vízfürdőben 37 'C hőmérsékleten inkubáljuk. Egy további vizsgálati elegyből, amely inhibitort nem tartalmaz, inkubálás nélkül összesen hat mintát (egyenként 100 pl) veszünk a kiinduló angiotenzn I tartalom meghatározására. A vizsgálati készítmények koncentrációját úgy választjuk meg, hogy mintegy 10-90%-os enzimgátlásnak feleljen meg (legalább öt különböző koncentráció). Az inkubálás végén minden elegyből háromszor 100 pl mintát veszünk egy előre lehűtött Eppendorf edényben, majd száraz jégen fagyasztjuk és mintegy -25 ”C hőmérsékleten tároljuk az angiotenzin I mennyiségének meghatározásáig (három mérésből számolunk átlagértéket). Az angiotenzin I radioimmuno assay vizsgálatához pontosan betartjuk a Renin-Maia készlet előírásait. A koncentrációgörbét 0,2-25,0 ng/ml angiotenzin I koncentrációnál vesszük fel. Az alap angiotenzin I tartalmat minden mérési eredményből levonjuk. A plazma renin-aktivitást (PRA) az angiotenzin I-re vonatkoztatott ng/ml x óra mértékegységben adjuk meg. A vizsgált hatóanyag jelenlétében mért PRA értéket inhibitor nélküli minta eredményére, mint 100%-ra vonatkoztatjuk és ez alapján százalékos maradék aktivitást adunk meg. A maradék aktivitást a vizsgált hatóanyagkoncentrációjával szemben ábrázolva meghatározzuk az IC50 értéket. Az új (I) általános képletű vegyületek in vitro körülmények között 10 -10’10 mól/1 koncentrációban mutatnak gátlást. A renin-gátlók sószegény állatokban csökkentik a vérnyomást. Mivel az emberi renint megkülönböztetik a más fajoktól származó renintől, az in vivo vizsgálatokhoz főemlősök, például Rhesus-majom alkalmazhatók. A főemlős renin és a humán renin szekvenciájában messzemenően homológ. Furoszemid i.v. injekció formában történő beadásával endogén renin kiválasztást váltunk ki. A vizsgált hatóanyagot folyamatos infúzió formájában adagoljuk és a vérnyomásra és a szívfrekvenciára gyakorolt hatását mérjük. Az új (I) általános képletű hatóanyagok mintegy 0,1-5 mg/kg i.v. dózisban hatékonyak gasztroszkópon keresztül intraduodenálisan adagolva a dózishatár mintegy 1 -50 mg/kg. Az új (I) általános képletű vegyületek tehát felhasználtatok a magas vérnyomás csökkentésére és szívelégtelenségek kezelésére. A HÍV proteáz a GAG-POL polipeptidből auto-6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
