203367. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szomatotropinok kinyerésére híg vizes oldatból
HU 203367B 5 6 ofilizálással eltávolítjuk. Ha a centrifugált vagy szűrt szomatotropiní alacsony hőmérsékleten, vákuumban kívánjuk szárítani, a szárítást 0 és 5 °C közötti hőmérsékleten végezzük. A találmány szerinti eljárással kapott száraz szó- 5 matotropin bioaktivitása lényegében a liofilizálással kapott vagy természetes szomatotropin bioaktivitásával azonos. Emellett a rekombináns sertés szomatotropin in vivo adagolásának szimulálására végzett in vitro kísérletek azt mutatták, hogy EDTA 10 jelenlétében az oldhatóság javult, ha a hagyományos liofüizálás helyett a szomatotropint a találmány szerinti eljárással nyertük ki. A következő példák csupán a jelen találmány bemutatására szolgálnak és nem tekintendők korláto- 15 zóaknak. 1. példa Rekombináns sertés szomatotropin kicsapása Tisztított liofilizált A7 rekombináns sertés szó- 20 matotropinból (A7rpST, rekombináns sertés szomatotropin, amelynek szekvenciája megegyezik a teljes hosszúságú természetes sertés szomatotropinéval, azzal az eltéréssel, hogy az első 7 N-terminális aminosav hiányzik; részletesen ismertetik a 25 104 920 számú közzétett európai szabadalmi bejelentésben), International Minerals and Chemical Corporation, sarzsszám CF008-OBA.94.1, ionmentes vízben (dH20) 100 mg A7rpSt/ml koncentrációjú oldatot készítettünk. Az anyagot 100 térfo- 30 gat karbonát pufferrel (0,42 mmól nátrium-karbonát, 0,50 mmól nátrium-hidrogén-karbonát, amelynek a pH-ját sósavval 7,4-re állítottuk) szemben dializáltuk, és a dializált anyag egy részét kilenc rész 7,4-es pH-jú karbonát pufferrel hígítottuk. A kapott két A7rpST oldathoz (10,0 és 1,0 mg A7rpST/ml) ugyanolyan sarzsszámú l2jl-A7rpST-t adunk olyan mennyiségben, hogy az oldatok végkoncentrációja 0,02 (j. Curie/ml legyen. így lehetővé vált a kicsapás százalékának meghatározása a centrifugáláskor kapott felülúszó radioaktivitásának mérése útján. Ehhez a kicsapási kísérlethez átmeneti fém sójaként cink(II)-kloridot, Mn(II)-kloridot és réz(Ó)kloridot választottunk. Mindegyik sóból 24 mmól, 2,4 mmól és 0,24 mmól koncentrációjú oldatot készítettünk. Pozitív kicsapási kontrollként 20%-os triklór-ecetsav-oldatot használtunk. A fémsó vagy triklór-ecetsav-oldatból 0,5 ml-t a A7rpST-t tartalmazó oldat 0,5 ml-éhez adtunk, és a ldcsapást egy órán át, szobahőmérsékleten végeztük. A kivált anyagot 15000 g-n szobahőmérsékleten centrifugálva szemcséztük. A dupla csövekben lévő felülúszóból 0,5 ml-t kivettünk és polipropilén csőben számláltuk a beütéseket. A minimális beütésszám a háttér négyszerese volt. A szemcseképződést vizuálisan ítéltük meg, és jó szemcse mérete és a kivált zött. Ez azt mutatta, hogy zett A7rpST-hez hasonlóan viselkedett. Az I. táblázatban láthatók a kísérlet eredményei, 0,5 és 5 mg A7rpST/ml koncentrációnál műid a cink-klorid, mind a réz(H)-klorid jó kicsapó tulajdonságokat mutatott egy vagy több reagens koncentrációnál. A réz(II)-klorid kivételével a fémsó mennyiségének növelése azonos vagy növekvő A7rpST kiválást eredményezett. összefüggést találtunk a I-A7rpST százalék köa 125I-A7rpST a nem jel-I. táblázat Kicsapószer Akicsapószer koncentrációja Akicsapás hőmérséklete Akicsapott 2 5 mg/ml és koncentrációjú A7rpST %-aa 0,5 mg/ml A7rpST oldat esetén Fémsó Cink-klorid 12 mmól RT* 76 ±0,38 77 ±0,96 1,2 mmól RT 76 ±1,5 74 ±0,56 0,12 mmól RT 55 ±0,41 61 ±0,21 Mangán-klorid 12 mmól RT 27 ±1,2-21 ± 1,6 1,2 mmól RT 22 ±0,31 19 ±2,4 0,012mmól RT 8,7 ±0,654 15 ±2,0 Réz(II)-klorid 12 mmól RT 23 ±4,6 17 ±2,9 1,2 mmól RT 64 ±8,7 44 ±6,7 0,12mmól RT 42±0,11 67 ±0,12 Kontrollok Nincs — RT 4,3 ±0,89 13 ±1,2 — 4 °C 7,2 ±2,1 18 ±0,80 Triklór-ecetsav 10%-os oldat RT 98 ±0,33 96 ±0,59 10%-os oldat 4 °C 98 ±0,24 97 ±0,26 a) Az adat átlagot jelent ± standard eltérést, ha n=2 XRT szobahőmérséklet 4
