203367. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szomatotropinok kinyerésére híg vizes oldatból
HU 203367B 2. példa A különböző puff erek és pH körülmények hatása a A7rpST kicsapására Az 1. példában használttal azonos sarzsszámú tisztított liofilizált A7rpST-ből dH20-val 10 mg/ml 5 koncentrációjú oldatot készítettünk, és ebből egyegy részt a következő pufferekkel szemben dializáltunk: 1. karbonát puffer, pH 7,4; 2,40 mmólos Trisz HC1, pH 7,4; vagy 1, <50 mmólos etanol-amin, pH 9,8. A három mintát1 i-A7rpST-vei elegyítettük az 1. 10 7 példában leírtak szerint. A DL táblázat a kísérlet eredményeit mutatja. Az adatok szerint a cink különböző pufferekből és pH-n képes a A7rpST hatékony kicsapására. Minden mintát 24 mmól-os cinkklorid oldattal 1:1 arányban hígítottunk, és a A7rpST kicsapási százalékát az első példában leírtak szerint meghatároztuk. A n. táblázat mutatja a kísérlet eredményeit. Az adatok szerint a cink különböző pufferekből és pH- értékeken képes a A7rpST hatékony kicsapására. 8 II. táblázat A 25I-A7rpST 10 mg/ml koncentrációjú A7rpST-oldat és 24 mmól-os cink-klorid azonos térfogatából készült oldatból (1) 7,4-es pH-jú karbonát puffer, (2) 7,4-es pHjú 50 mmól-os Trisz puffer és (3) 60 mmól-os etanol-amin jelenlétében való kicsapódás százalékban kifejezve Puffer PH Aszemcsézett 125I-A7rpST százaléka8^ karbonát 7,4 76 ±0,38 50 mmól trisz 7,4 81 ±0,11 60 mmól etanol-amin 9,8 90 ±0,52 (a) Az adatok átlagértékek ± állandó eltérés, ha n- 2 3. példa A kicsapott A7rpSToldhatósága és bioaktivitása A kicsapási kísérlethez 500 mg az 1. példában 30 használttal azonos sarzsszámú A7rpST-t 50 ml ionmentes vízzel (dH20) elegyítettünk, ekkor a maradék karbonátionoktól az elegy pH-ja 10,3 volt. Az anyagot körülbelül 7,4-es pH-n karbonát pufferrel szemben extenzíven dializáltuk addig, amíg a diali- 35 zátum pH-ja 7,6 lett. A dialízis során a térfogatnövekedés 5 ml. Három milliekvivalens sósavval a dializátum pH-ját 7,4-re csökkentettük, és az oldat szobahőmérsékleten 1500 g-n centrifugálva kitisztult. A semleges A7rpST oldatból 10 ml részt vettünk ki és azonos térfogatú 2,4 mmólos cink-ldoriddal vagy 2,4 mmólos réz(Il)-kloriddal elegyítettük. Egy órás, szobahőmérsékleten való keverés után 15000 g-n centrifugáltuk a szuszpenziót. A szemcséket -80 "C-on megfagyasztottuk és egy párhuzamos, 20 ml dH20-val hígított, semleges pH-jú A7rpST mintával együtt liofüizáltuk. A meghatározások eredményei a Hl. táblázatban láthatók. II. táblázat Kicsapási eljárás A7rpST (%/t/t) száraztömeg (mg) A A7rpST tömege (mg) A kicsapás relatív hatékonysága ZnCl2 115 54,5 62,7 81 CuCl2 105 48,0 50,4 65 Liofüizálás 118 65,7 77,5 100 Annak meghatározásá, hogy a fémsók a A7rpST bioaktivitására müyen hatást gyakorolnak, egy növekedési vizsgálatot (testtömeggyarapodás-meghatározást) végeztünk olyan patkányokkal, amelyek 55 hipofízisét eltávolítottuk (lásd Parlow, S. F. és munkatársai: Endocrynology, 77,1126-1134/1965/). A tesztet azért végeztük, hogy a szomatotropin bioaktivitására a találmány szerint kinyert A7rpST adagolásakor fellépő növekedésserkentő halas mérése 60 alapján következtessünk. A kísérlethez a vizsgálat megkezdésekor 36 napos olyan nőstény patkányokat használtunk, amelyek hipofízisét eltávolítottuk, és az állatokat tizes csoportokba osztottuk. A csoportosítást tömeg sze- 65 rint végeztük úgy, hogy az átlagos kiindulási tömeg minden csoportban közel azonos volt. Minden patkány csoporthoz rendeltünk egy kezelést. A patkányok küenc napon át minden nap szomatotropin vagy kontroll oldatot kaptak szubkután injektálva. Az injektálás a koponya alá, a lapocka alatti terület közelében történt. A szomatotropin szolubilizálására a következő Parlow puffer oldatokat használtuk: I. NaHC03 (0,03 mól), NaCl (0,15 mól), a pH 8 mólos nátrium-hidroxiddal 10,8-re állítva. n. NaHC03 (0,03 mól), NaCl (0,15 mól), a pH 8 mólos nátrium-hidroxiddal 9,5-re állítva. A A7rpST ismét mennyiségét (lásd a Hl. táblázat) 5
