203367. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szomatotropinok kinyerésére híg vizes oldatból
HU 203367B 3 4 juk be. Egy biológiailag aktív szomatotropin fokozhatja az élőlény tápanyaghasznosítását, a tápanyag eloszlást és a tőkehús minőségét is, ha az adott élőlénynek megfelelő mennyiségben adagoljuk. A találmány szerint egy híg, vizes, szomatotro- 5 pint tartalmazó oldathoz, amely legfeljebb 1% szomatotropint tartalmaz, adott esetben tisztított és adott esetben puffert is tartalmaz, átmeneti fémek sóit adjuk. Kívánatos, hogy a szomatotropin az oldatban tökéletesen szabad, bioaktív formájában le- 10 gyen jelen. Az átmeneti fémek sói a szomatotropinnal oldhatatlan komplexeket képeznek, így a híg vizes oldatokból a szomatotropint kicsapják. A komplexek szomatotropjn molekulákból és fémionokból, így Zn , Cu , Co, MN2+, Fe2+vagy Fe3+ ionok- 15 ból állnak. Ezek a komplexek ligand kötéseket tartalmaznak a fémion és a szomatotropin néhány aminosavának nitrogénatomjai között. A szomatotropin-fémkomplex kiválása után a csapadékot a vizes közeg nagy részétől tömény vizes szuszpenzió for- 20 májában különíthetjük el. Az oldhatatlan komplexeket aztán a még jelenlévő víz eltávolításával száríthatjuk. A kapott termék szárított szomatotropinátmeneti fémkomplex. Kimutatták, hogy a termékben jelenlévő átmeneti fém nem befolyásolja káro- 25 san a szomatotropin bioaktivitását, amikor a terméket élőlénynek beadják. Mint fentebb megjegyeztük, a szomatotropin hagyományos előállítási eljárásaival kapott természetes szomatotropin táptalajos oldatai a szomatot- 30 ropin tömegére vonatkoztatva nagymennyiségű vizet tartalmaznak. Az üyen oldatokban például a szomatotropin egy grammjára számítva körülbelül 100 g víz van. A hagyományos kinyerési eljárások során a víz teljes mennyiségét liofilizálják. Ezzel 35 szemben, ha a találmány szerinti eljárást alkalmazzuk, és az oldathoz átmeneti fém sóját adjuk, hogy a szomatotropint szomatotropin-átmeneti fémkomplex formájában kicsapjuk, a kezdetben nagy térfogatban jelenlevő vizet könnyen elválaszthatjuk a 40 csapadéktól, így tömény, vizes szuszpenziót kapunk, amit szárítani kell. Ha az oldatban kezdetben például 100:1 víz és szomatotropin aránya, a tömény szuszpenzióban általában 5:1. így az eltávolítandó víz mennyiségét huszadrészére csökkenthet- 45 jük, A szomatotropin átmeneti fémmel alkotott bioaktiv komplexével együtt lévő víz sokkal gyorsabban és kevésbé költséges eszközzel távolítható el, mint amüyen a liofüizáláshoz szükséges. A találmány 50 szerinti eljáráshoz szükséges munka igen lényeges megtakarítását eredményezi. A találmány szerinti eljárásban használható átmeneti fémek a cink, réz, mangán, vas és kobalt. Ezek közül előnyösek a cink, réz és mangán, a lege- 55 lőnyösebb a cink. A találmány szerinti eljárásban alkalmazható fémek különösen hatásos sói a kloridok, így a cink-, réz-, mangán-, vas- és kobal t-klorid, de más sók, így szulfátok, acetátok vagy tartarátok is használhatók az eljárásban. 60 A jelen módszer alkalmas például szomatotropin olyan híg, vizes oldatokból való kinyerésére, amelyeket különféle tisztítási eljárások eredményeként kapunk. A találmány szerinti eljárással kinyerhető szomatotropin kimetszett hipofízis szövetből vagy 65 olyan, genetikailag átalakított mikroorganizmusokból való elkülönítéssel kapható, amelyek szomatotropin termelést specifikáló rekombinánsDNS-t tartalmaznak. Azok a vizes oldatok, amelyekből a szomatotropint kell kinyerni, különböző mennyiségű szomatotropint tartalmazhatnak. Olyan mennyiségben kell az átmeneti fém sóját az oldathoz adni, amely elegendő a szomatotropin kicsapásához; ehhez az átmeneti fém sóját a szomatotropinhoz képest feleslegben alkalmazzuk. Általában, laborméretű reakciók esetén, annyi fémsót adunk az oldathoz, hogy 0,025 mmól/1 szomatropin esetén a koncentrációja körülbelül 0,12 és körülbelül 12 mmól/1 között legyen. A fémsó tömege üyen reakciókban általában körülbelül 1,2 mmól fémsó 1 literben lévő 0,025 mmól szomatotropinra számítva. A szomatotropin kicsapásához elegendő átmeneti fém tömege azonban változhat. A bejelentés 10. példája szerint nagyléptékű reakcióban például azt találtuk, hogy körülbelül 10 mól cinksó:! mól rekombináns sertés szomatorropin arány kellett a szomatotropin kicsapásához. A kicsapáshoz szükséges mennyiségeket a szakember rutinvizsgálattal meg tudja határozni. A szomatotropin átmeneti fémmel alkotott komplexe végtermékként általában 1 mól szomatotropinra vonatkoztatva 1-8 mól fémet tartalmaz. Tömeg%-ban kifejezve a termék átmeneti fém tartalma 0,3 és 9 közötti. A termék előnyösen körülbelül 0,4 és körülbelül 7 közötti tÖmeg% fémet tartalmaz. A szomatotropin kicsapását előnyösen közei semleges vagy bázikus oldatban végezzük. Kívánatos, hogy a vizes oldat pH-ja 6,8 és 9,8 között legyen. A szomatotropin híg vizes oldatából legelőnyösebben 7,4 és 9,0 közötti pH-n lehet a szomatotropint hatékonyan kinyerni. A szomatotropin vizes oldataiban különféle puffereket használhatunk. Ezeket azért adjuk az oldathoz, hogy egy adott pH-értéken az átmeneti fém hozzáadása előtt a szomatotropint oldatban tartsuk. Az olyan puffereket körültekintéssel kell használni, amelyek a Zn2+, Cu2+, Co2+, Mn2+, Fe2+ és Fe3+ fémionokkal oldhatatlan sókat alkotó anionokat tartalmaznak. A jelen eljárásban használható puff erek például a karbonát puífer (0,42 mM nátrium-karbonát, 0,50 mM nátrium-hidrogén-karbonát, amelynek a pH-ját 7,4 és 9,8 közöttire állítjuk); 50 mM-os Trísz hidroklorid körülbelül 7,4 pH-n; és 60 mM-os etanol-amin körülbelül 9,8-es pH-n. Az átmeneti fém sójának hozzáadására a híg, vizes szomatotropin tartalmú oldatból fém-szomatotropin komplex csapódik ki. A fém-szomatotropin komplex kiválása alatt az oldatot célszerű keverni. Miután az átmeneti fém sóját hozzáadtuk a híg, szomatotropintartalmú oldathoz és a szomatotropin oldhatatlan szomatotropin-fém komplex formájában kicsapódott, az oldhatatlan komplexet elválasztjuk a vizes oldattól és megszáríthatjuk. Az elválasztást hagyományos módszerrel, például centrifugálással vagy szűréssel, vagy a kettő kombinálásával végezhetjük. A kivált anyagok szobahőmérsékleten centrifugáljuk vagy szűrjük, és a kívánt esetben hagyományos módon szárítjuk, így például a vizet alacsony hőmérsékleten vákuumban vagy li-3
