203363. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2',3'-didezoxi-2',2'-difluor-nukleozidok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
HU 203363B 19 20 tásának kimutatására, amilyenek pl. a vinka-alkaloidok. A megfelelő irodalmi források pl.: Miller et al., J. Med.Chem. 30,3, 409, 1977 és Sweeney et al.. Cancer Research 38,2886,1978. A találmány szerinti (I) általános képletű vegyiiletek citotoxikusak olyan vonatkozásban, hogy gátolják a humán leukémia sejtek (CCRF-CEM sejtvonal) növekedését. A következő 1. Táblázatban az (I) általános képletű jellegzetes vegyületek néhány képviselőjének vizsgálati eredményeit mutatjuk be. A Táblázatban az 1. oszlopban a vegyületre vonatkozó példa számát, a 2. oszlopban pedig az IC50 értékeket (az 50%-os növekedésgátlást eredményező koncentráció, mcg/ml) adjuk meg. 1. Táblázat A citotoxicitásra vonatkozó szűrés eredményei Vegyület IC50 mcg/ml 1. példa 1,9 2. példa 1,9 3. példa 8,5 4. példa 23.4 5. példa 20 felett A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek hatásosak vírusfertőzések, különösen olyan vírusfertőzések kezelésére, amelyeket a Herpes genusba tartozó vírusok okoznak. Ennélfogva a találmány szerinti vegyületek vírusfertőzések emlősökben való kezelésére is alkalmazhatók, amely abban áll, hogy az üyen kezelésre szoruló emlősöknek az (I) általános képletű vegyületekből egy vírusellenes hatás szempontjából hatásos mennyiséget adagolunk be. A leírásban használt értelemben a „vírusellenes hatás szempontjából hatásos mennyiség” kifejezés az (I) általános képletű vegyület olyan, megfelelő mennyiségére vonatkozik, amely képes vírusfertőzések emlősökben való kialakuláának megelőzésére vagy gátlására. Általában használhatók a kb 5 mg/kg — kb. 500 mg/kg tartományba eső dózisok. Inkább előnyben részesítjük azonban azt a megoldást, hogy a kb. 10 mg/kg — kb. 100 mg/kg tartó mányba eső dózisok. Inkább előnyben részesítjük azonban azt a megoldást, hogy a kb. 10 mg/kg — kb. 100 mg/kg tartományba eső dózisokat alkalmazzuk. Az (I) általános képlet körébe tartozó vegyületek alkalmazhatók olyan megbetegedések kezelésére vagy megelőzésére, amelyeket rendszerint széles körbe tartozó vírusok okozhatnak. Néhány jellegtetes vírus, amelyekkel szemben a találmány szerinti vegyületek sikeresen alkalmazhatók: az influenza vírus valamennyi A és B törzse; a parainfluenza vírus; magzati légzőszervi megbetegedést okozó vírusok; a különböző herpes I és II törzsek, echo- és vaccinia-vírusok, kanyaróvírus, Semliki Forest vírus; retrovírusok — pl. a Friends leukémia vírus és az AIDS vírus. A következőkben bemutatandó plakk szám csökkentési vizsgálat a vírus szaporodását gátló anyagok 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 kvantitatív értékelését teszi lehetővé és segítségével meghatározható a találmány szerinti vegyületek egy jellegzetes képviselőjének antivirális aktivitása. Ezen vizsgálat szerint érzékeny sejtek (BSC-1, HeLa, MDCK, stb.) 25 cm2 es Falcon lombikokban tenyésztünk 37 °C-on, 199. sz. közegben, amelyhez 5% inaktivált borjúembrió szérumot (FBS), penicillint (150 egység /ml) és streptomicint (150 p.g/ml) adtunk. Összefüggő egyrétegű tenyészet kialakulása után a tenyészközeget eltávolítjuk és az egyes lombikokhoz 0,3 ml megfelelően hígított vírus tenyészet oldatot adunk. A vírust 1 órán át szobahőmérsékleten adszorbeálódni engedtük, majd a fertőzött sejteket tartalmazó rétegre azonos mennyiségű 1%-os agaróz táptalajt és 2x199 közeget, 2,5% FBS-tartalommal (penicillin és streplomicin hozzáadása mellett) viszünk fel. A vizsgálandó vegyületet dimetil-szulfoxidban (DMSO) oldjuk; az oldat koncentrációját 1000 pg/ml értékre állítjuk be és ennek az oldatnak egy alikvot mennyiségét agar táptalaj keverékkel a kívánt koncentrációra állítjuk be, A lombikokat 37 °C-on inkubáljuk, amíg a kontroll lombikokon megjelennek az optimális méretű (kb. 2-kb. 10 mm-es) plakkok. Mindegyik edényhez egy 10% formaiint (térf.%) és 2 térf.% nátriumacetátot tartalmazó oldatot adunk a vírus inaktiválására és a sejtrétegnek a képlékeny felülethez való rögzítésére. A pakkokat azt követően számláljuk meg, hogy a környező sejt-terleteket kristályibolyával megfestettük. Az egyes koncentrációkhoz tartozó két-két lombikkal kapott eredményeket átlagoljuk és az eredményt összehasonlítjuk a kontroll lombikkal kapott eredménnyel. HSV-1 esetében a következő mértékű gátlás figyelhető meg: Vegyület Koncentráció Gátlás 1. példa 15 p-g/ml 50% 2. példa 3,1 p.g/ml 27% 3. példa 25 (jLg/m! 39% 5. példa 25 p-g/rnl 35% HSV-2 esetében a következő mértékű gátlást figyeljük meg. Vegyület Koncentráció Gátlás 3. példa 25 p.g/ml 21% 4. példa 13,5 jJLg/ml 50% A következő eljárást arra használjuk fel, hogy meghatározzuk egy találmány szerinti, jellegzetes vegyület hatékonyságát a Friends-f. leukémia vírussal szemben. Egér embrióból származó SC-1 sejteket csaknem összefüggő tenyészet kialakítása mellett, 2- 5xl03 sejt/lyuk mennyiségben felviszünk egy 96 mikronyílást tatalmazó lemezre. A tenyésztéshez teljes MÉM táptalajt alkalmazunk, amely 2 mcg/ml polybrene-t tartalmaz. A tenyésztést egy éjjelen át folytatjuk 37 ’C-on, széndioxid atmoszférában. A 11
