203257. lajstromszámú szabadalom • Eljárás monoklonális anti-urokináz antitestek előállítására, valamint urokináz tisztítására és vizsgálatára
1 HU 203 257 B 2 lopra felvitt fibrinolitikus aktivitás 70-80%-a mutatható ki. Ha a meg nem kötött frakciókat visszavisszük az oszlopra, a teljes aktivitás a kifolyóban mutatható ki. Ez arra mutat, hogy ez az aktivitás valószínűleg nem az urokináznak tulajdonítható, hanem inkább egy aspecifikus, fibrinolitikus aktivitással rendelkező proteáz jelenlétére mutat, amely nem rokon az urokinázzal. Lényegében az előbbi eljárást követve, de vizeletet (4 liter) alkalmazva vizeletkoncentrátum helyett olyan urokinázt kapunk, amely lényegében az előbbi jellemzőkkel rendelkezik. 5. példa A43l sejt felülúszójának elállítása A43l sejteket tenyésztünk Dulbecco-f. módosított Eagle-f. táptalajban, amely 10% borjúembrió szérumot (Flow Laboratories), 100 E/pü penicillint, 100 pg/ml streptomicint, (Flow Laboratories) és 2mM glutamint (Flow Laboratories) tartalmaz, 150 cm2 növekedési felületet biztosító műanyag tenyésztő lombikokban (NUNC), amíg a sejtek össze nem folynak. Ezután összegyűjtjük a felülúszókat, a sejtmaradékok eltávolítására centrifugáljuk és proteáz inhibitor (aprótinin, 10 pg/ml) jelenlétében a felhasználásig -80 °C- on tároljuk. 6. példa Az egyláncú urokináz prekurzor kinyerése és tisztítása A431 sejtekből 5B4-agarózon végzett immunaffinitás-kromatográfiával. Az 5. példa szerint előállított centrifugált felülúszóból 1,5 litert felviszünk egy 5B4-agaróz immunadszorbcns oszlopra (10 mmx30 mm), amelyet lényegében a 2. példa szerinti eljárással állítottunk elő és előzetesen pH 7 0,15M NaCl-0,05M Na-foszfát pufferrel hoztunk egyensúlyba; az áramlási sebesség 40 ml/óra. Az oszlopot 50 ml egyensúlyozó pufferrel mossuk és 1M NaCl-0,lM ecetsavoldattal eluáljuk. A frakciók urokináz antigén tartalmát a kettős antitest szendvics immun-módszerrel vizsgáljuk meg, amely 5B4 monoklonális antitestek alkalmazását irányozza elő (1. a 70. példát). A kapott terméket (egyláncú urokináz prekurzor, SC-UK) pH 4,8-n -80 °C-on tároljuk. Ennek a terméknek a fibrinolitikus aktivitását a fibrinlemez módszerrel határozzuk meg (J. Plough et al.; Biochim. Biophys. Acta 24, p. 278,1957), míg az amidolitikus aktivitást Sherry, et al. módosíott eljárásával (J. Lab. Clin. Med. 64, p. 145,1964) értékeljük, acetillizin-metüészter (ALME) alkalmazásával. Az aktiválást úgy érjük el, hogy 10 pg tisztított SC-UK-t 4 pg plazminnal (Sigma) keverünk össze 0,4 ml vértérfogatban pH 6 0,5M NaCl-0,05M Na-foszfát pufferben. Ezt szobahőmérsékleten végzett inkubálás követi. Különböző időpontokban vett mintákban meghatározzuk az amidolitikus aktivitást. A plazmin reakcióját úgy állítjuk le, hogy 10 pj puff erben oldva 100 pg aprotinint adagolunk. Az SDS-poliakrilamid gélelektroforézist (SDS-PAGE) redukáló és nem redukáló körülmények között Laemmli módszere (Nature, 227, p. 1970) szerint végezzük. Az immun-foltképzési vizsgálatokat lényegében az előzőekben leírtak szerint végezzük (G. Salemo et el., Proc. Natl. Acad. Sei. 81, p. 110,1984) oly módon, hogy az immunreakcióban tiszta MAB 5B4-t, antiurokinázt és (anti-szöveti PA)-antiszérumokat alkalmazunk. Az MAB 5B4 immun-foltképzési térképe arra mutat, hogy reakció megy végbe a HMW urokinázzal és a HMW urokináz A-láncából levezethető 18000 molekulatömegű proteolitikus fragmentummal. Ez azt jelzi, hogy a külső pontnak az A-láncon kell elhelyezkednie. Ha a HMW urokinázt beta-merkapto-etanollal redukáljuk, nem figyelhető meg redukció. Ez ahhoz a feltevéshez vezet, hogy a redukálószer által előidézett konformációváltozások károsítják a külső pontot. A termék SDS-PAGE elemzése egy fő sáv jelenlétére mutat, amely egy 52000 molekulatömegű egyszeres polipeptid láncnak felel meg. Ez az érték valamivel alacsonyabb, mint a humán urokináz SDS-PAGE-vel meghatározott látszólagos molekulatömege (54000). Az SC-UK monoklonális vagy poliklonális anti-urokináz antitestekkel végzett immun-foltképzési reakciói arra mutatnak, hogy a fehérje immunológiailag az urokinázzal rokon. Anti-szöveti PA-val nem figyeltünk meg reakciót. Az SC-UK-t a továbbiakban fibrinolitikus és amidolitikus aktivitása tekintetében jellemezzük. Az SCUK fibrinolitikus aktivitása - a fibrinlemezmódszerrel mérve - 18 823 IU/ml (OD280) értékűnek bizonyul, azaz hetedakkora, mint a tiszta, 54000 molekulatömegű urokináz fajlagos aktivitása. Az amidolitikus aktivitás is - az ALME szintetikus szubsztátumon mérve - kb. 1/12-e volt az urokinázénak. Az amidolitikus aktivitás azonban plazminnal végzett kezelés után 8-szorosára nőtt. Ez a növekedés azzal függ össze, hogy az egyszeres láncú fehérje kettős láncúvá alakul át, amely elektroforetikusan hasonló a humán urokinázhoz. Ez azt erősíti meg, hogy az SC-UK a humán urokináz prekurzora. A tisztításra vonatkozóan néhány kvantitatív adatot a következő oldalon lévő táblázatban mutatunk be. 7. példa Kettős antitest szendvics (EL1SA) módszer Rugalmas, 96 lyukú mikrotitráló lemezeket (FALCON 3912) 100 pJ/lyuk mennyiségben bevonunk tisztított anti-UK IgG-kel (egy előállítási módszert az utóbbival kapcsolatban a 8. példában mutatunk be), amelyet 1:200 arányban pH 7,2 PBS-sel hígítottunk (10 pg/ml IgG-ok) és 1 órán át 37 °C-on inkubálunk. 0,05%-os PBS-Tween oldattal való mosás után a lyukakat 2 órán át szobahőmérsékleten 250 pJ/lyuk mennyiségben 3%-os PBS-BSA-val hozzuk érintkezésbe, a be nem vont műanyag felület blokkolására. Ezt az oldatot eltávolítjuk, mindegyik lyukba bemérünk 100 pl megfelelő hígítású standard urokinázoldatot -10% borjúembrió-szérummal dúsított Dulbecco-f. módosított Eagle-f. táptalajban (DMEM, Flow Laboratories) - vagy 100 pl A431 sejt-felülúszót és egy éjjelen át szobahőmérsékleten hagyjuk végbe-5 10 16 20 25 30 35 40 45 50 55 60 10
