203257. lajstromszámú szabadalom • Eljárás monoklonális anti-urokináz antitestek előállítására, valamint urokináz tisztítására és vizsgálatára

1

HU 203 257 B

2

Hl. táblázat

Az SC-UK tisztítása A43 j sejt felülúszóból 5B4-agaróz oszlopon végzett affinitáskromatográfiával

Frakció

Téri.

(ml)

Urokináz antigén3* (pg) %

Fibrinolitikus

aktivitás

(U.L/ml)

Optikai sűrűség 280 nm

U.I.

C®280

nyersanyag

1100

265,0

100,00-meg nem kötött frakció

1150

6,7

2,5-megkötött frakció

6

176,7

66,7

640

0,034

18823

a* kettős antitest szendvics immunmeghatározási módszerrel mérve

menni a reakciót. A mikrotitráló lemezeket ezután 0,05%-os PBS-Tween oldattal mossuk és 100 pl/lyuk mennyiségű 5B4-HRP konjugátummal (előállítási módját 1. a 9. példában) - amelyet 1:100 arányban 20 0,3% PBS-BSA-t és 0,05% Tween-t tartalmazó oldattal hígítunk - inkubáljuk 30 percen át 37 °C-on. Mosás után a mikrotitráló lemezeket 200 pl/lyuk mennyiségben 30 percen át 37 °C-on pH 5 0,1M nátriumcitráttal készített 1 mg/ml töménységű o-fenilén-diamin oldattal inkubáljuk, amely H202-re nézve 5mM töménységű. A reakciót 4,5M H2S04-gyel állítjuk le és 492 nmen leolvassuk az optikai sűrűséget. Külön-külön határozzuk meg a vakoldat, a standard oldatok és a vizsgálati oldatok optikai sűrűségének átlagértékeit. Miután 30 a vakoldat optikai sűrűségértékeit kivonjuk a standard oldatokéiból, illetve a meghatározandó mintákéiból, a meghatározandó minták urokináztartalmát úgy kapjuk meg, hogy a kalibrációs görbén interpoláljuk a megfelelő kompetíciós arány értékeket. A kalibrációs 35 görbét előnyösen féllogaritmikus papíron rajzoljuk fel: az egyes standard minták 492 nm-en mért optikai sűrűségét vesszük fel a megfelelő urokinázkoncentrációval szemben. Hitelesítési vizsgálatok arra mutatnak, hogy a meghatározáson belüli pontosság (CV) 4 és 40 8% között váltakozik, míg a meghatározások közötti pontosság (CV) általában 7-23%. Az analitikai visszanyerés 87-114%. Az alkalmazási tartomány 15- 100 mg/ml antigén.

8. példa

Anti-urokináz immunglobulinok tisztítása egy szokásos anti-UK antiszérumot kiindulva

Nyúl anti-UK antiszérumot állítunk elő a szokásos immunizálási eljárás szerint, nagy tisztaságú, 54 000 molekulatömegű urokinázt (kb. 120000 IU/mg) alkalmazva.

Pontosabban: egészséges New Zealand fehér nyulakat immunizálunk 500 pg nagy tisztaságú, 54000 molekulatömegű urokinázzal (kb. 120000 IU/mg), amelyet komplett Freund-f. adjuvánsban oldunk.

4,6 és 8 hét múlva emlékeztető oltásokat adunk ugyanilyen mennyiségű antigénnel, inkomplett Freund-f. adjuvánsban oldva. Az állatokból hetenként vérmintát veszünk és az anti-urokináz antiszérum enzim-immunmeghatározás segítségével meghatározzuk az anti-urokináz antitest titereket. 12 hét után az állatokat elvéreztetjük és fehérje-A Sepharose-on végzett affinitáskromatográfiával tisztítjuk az IgG immunglobulin frakciót.

A kapott antiszérumból 1 ml-t felviszünk egy Protein A-Sepharose oszlopra, 20 ml/óra sebességgel, amelyet előzetesen pH 8 0,1 M nátriumfoszfát 25 pufferrel hoztunk egyensúlyba (oszlopméret: 1,6 cm x 4 cm). Ugyanezzel a pufferrel való mosás után az IgG-okát pH 3 0,1M ecetsavval eluáljuk. 2 mles frakciókat szedünk és az IgG-ok jelenlétét enzimimmunmeghatározással mutatjuk ki. Az IgG-t tartalmazó frakciókat pH 7,2-re állítjuk be és felhasználásig -20 °C-on tároljuk.

9. példa

Az 5B4 monoklonális antitest jelölése torma-peroxidázzal

Az MAB 5B4-t torma-peroxidázzal (HRP) jelöljük, keresztkötést képző reagensként glutáraldehidet alkalmazva, a következő eljárás szerint. 100 mg HRP-t 200 pl pH 6,8 0,1M nátriumfoszfát pufferben oldjuk, amely 1% glutáraldehidet tartalmaz, és szobahőmérsékleten 18 órán át állni hagyjuk a rendszert, a reakció lefolytatására. A reakcióelegyet 0,9%-os NaQ oldattal szemben dializáljuk és ugyanezzel az oldattal a térfogatot 1 ml-re egészítjük ki. Ezután 1 ml 0,9%-os 45 NaCl-ot adagolunk - amely 5 mg MAB 5B4-t és200 pl pH 9, 0,5M nátriumkarbonát oldatot tartalmaz - és 4 °C-on 24 órán át folytatjuk le a reakciót. A fennmaradó aktív csoportok blokkolására 100 pl 0,2M lizint adunk a rendszerhez és szobahőmérsékleten 2 órán át 50 állni hagyjuk.

A keveréket ezután egy éjjelen át 0,9%-os NaCl-dal szemben dializáljuk és SephacrylR S-200 géloszlopon (oszlopméret: 1,6 cm x 100 cm) szűrjük át, amelyet előzetesen fiziológiás sóoldattal hoztunk egyensúlyba 65 (áramlási sebesség: 14 ml/óra). A kromatográfiát oly módon követjük, hogy mérjük az áteresztést 280 nmen.

Az oszlop üres térfogatának megfelelő eluált anyagot (csúcs) összegyűjtjük és felhasználásig -20 6C-on 60 tároljuk.

11