203257. lajstromszámú szabadalom • Eljárás monoklonális anti-urokináz antitestek előállítására, valamint urokináz tisztítására és vizsgálatára
1 HU 203 257 B 2 A találmány egyik tárgyát képező tisztítási eljárásban alkalmazható monoklonális antitest kiválasztása problémájának jobb megvilágítása érdekében bemutatjuk a következő táblázatot. Ez a találmány szerinti kitüntetett - 5B4-nek nevezett - monoklonális antitest és egy, Salemo et al. által leírt (Proc. Natl. Acad. Sei. 81, p. 110,1984)ésmAB 105.1F 10-zel jelzett (az 5B4-éhez hasonló affinitási állandóval rendelkező) monoklonális antitest összehasonlításának eredményeit mutatja be. I. táblázat Az 5B4 ésal05.1F10 monoklonális antitest (mAB) affinitási állandói mAB Ka(ljnól-1) 105.1F 10 4,92 xlO6 5B4 1,42 xlO7 Ez a két monoklonális antitest - amely azonos osztályhoz (mindkettő IgGj) tartozik - azonos mennyiségben azonos mennyiségű aktivált agarózhoz kapcsolva (Affi-gel R10) lényegesen eltérő eredményeket ad urokinázkészítmények tisztításában. Közelebbről: ha azonos tisztaságú (897 észterolitikus egység) urokinázkészítményeket vezetünk át a két különböző immunadszorbensen, a megkötött frakció mennyisége a 105.1F 10 esetében 10%-nál alacsonyabb és az mAB 5B4 esetében 70%-nál magasabb (azaz 77,5%). A találmány szerinti monoklonális antitestek - az antigén iránti affinitásuk és specifikusságuk folytán - előnyösen alkalmazhatók a vizsgálati vagy meghatározási eljárásokban. Különböző markerekkel (pl. fluoreszkáló festékekkel, radioizotópokkal és enzimekkel) jelölhetők és felhasználhatók az immunfluoreszcenciában, radioimmunvizsgálatokban vagy az enzimes immunvizsgálatokban. A találmány egy további tárgya ezért a humán urokináz vagy ennek egy prekurzora enzim-immunvizsgálata, a találmány szerinti monoklonális antitestek segítségével. A humán urokinázt rendszerint fibrinolitikus vagy észterolitikus módszerrel határozzuk meg. Az első módszer egy vérrög lízisén alapul, amely annak eredményeként keletkezett, hogy az urokináz aktiváló hatására a plazminogén plazminná alakult át. A második módszer alapját az képezi, hogy az urokináz közvetlenül hidrolizál egy szintetikus szubsztrátumot, az acetil-lizin-metil-észtert (ALME). Ezért ezek a módszerek csak az enzim aktív alakját mutatják ki. Az urokináz inaktív prekurzorai - pl. a preprourokináz vagy a prourokináz - vagy az inhibitor-enzim komplexek ily módon nem határozhatók meg. Azok az immunológiái vizsgálatok viszont, amelyek a molekula antigén tulajdonságain - és nem az aktivitásán - alapulnak, lehetővé teszik mind az enzim aktív, mind inaktív alakjának meghatározását. Egy nagyon célszerű immunmeghatározási módszer - amely az urokináz vagy egy „inaktív” prekurzora (pl. egy urokináz zimogén vagy a prourokináz) kimutatására vagy meghatározására használható fel, a „kettős antitest szendvics” eljárás, amely a következőkből áll: a) egy kísérleti oldatot, amely az antigént tartalmazza, reagáltatunk egy 1. anti-urokináz antitesttel - amelyet szilárd fázisú hordozón rögzítettünk - az antigénnek a szilárd fázishoz kötése érdekében; b) a megkötött antigént érintkezésbe hozzuk egy, a 2. anti-urokináz antitestet tartalmazó oldattal, amelyhez előzetesen egy meghatározható markert kapcsoltunk (ennek során az 1. és a 2. antitest közül az egyik a találmány szerinti monoklonális antitest); c) kimutatjuk vagy meghatározzuk az antigént annak alapján, hogy a meghatározható marker milyen mértékben kötődött a szilárd fázisú hordozóhoz. Az 1. antitestet előnyösen a következők közül választjuk ki: anti-urokináz antiszérum, anti-urokinázzal tisztított immunglobulin G (IgGj) és egy monoklonális antitest, amelyről ismert, hogy az antigén egy olyan helyéhez kötődik, amely nem azonos a 2. antitest kötődési helyével (és nyilvánvalóan nem befolyásolja a 2. antitest kötődését). A „meghatározandóoldat” bármely olyan oldat lehet, amelyről feltételezhető, hogy tartalmazza a találmány szerinti monoklonális antitest által megköthető antigént. Ilyen pl. valamely biológiai folyadék, a fermentlevek, amelyeket pl. génsebészeti úton kapott mikroorganizmusokkal állítottunk elő, valamint a sejttenyészetek folyadéka és kivonatai. A 2. antitest előnyösen egy, a találmány szerinti monoklonális antitest, egy megfelelő, meghatározó ligandumhoz kapcsolva, amilyen pl. egy enzim, egy fluoreszcens festék vagy egy radioaktív csoport. Kitüntetett meghatározó marker egy enzim, és a kitüntetett „marker” a torma-peroxidáz. A találmány szerinti kitüntetett monoklonális antitest az előbbiekben leírt 5B4 jelű monoklonális antitest. Ha mind az 1., mind a 2. antitest monoklonális - amelyek közül az egyik a találmány szerinti monoklonális antitest, míg a másik egy további, humán urokináz elleni monoklonális antitest, amely az antigénnek nem ugyanahhoz a helyéhez kötődik, mint a találmány szerinti antitest és amelynek a kötődése nem befolyásolja a találmány szerinti monoklonális antitest kötődését, ezek általában az előbbiekben leírt meghatározási eljárásban felcserélhetők. Más szavakkal: a két monoklonális antitest közül bármelyik lehet az 1., és a fennmaradó 2. antitest és vica versa. Ezzel szemben olyan vizsgálat esetében, amelyben az egyik „antitest” egy szokásos antiszérum, ezt csaknem kivétel nélkül az 1. antitestként alkalmazzuk, mivel ebben az esetben a rendszer hatékonysága nagyobb, mint a fordított esetben. A monoklonális antitestnek az enzim markerhez való kapcsolását ismert módszerekkel végezzük. Kitüntetett kapcsoló reagens a glutáraldehid. Ha a meghatározható marker egy enzim, színfejlesztő, kromogén enzimszubsztrátumot alkalmazunk; ez a jelölő enzim ismert szintetikus szubsztrátuma, amely az en5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6
