203257. lajstromszámú szabadalom • Eljárás monoklonális anti-urokináz antitestek előállítására, valamint urokináz tisztítására és vizsgálatára
1 HU 203 257 B 2 zimmel való inkubálás után színes származékot eredményez. A szín intenzitását a vizsgálati vegyület standard készítményeiből kifejlesztett színekkel összehasonlítva mérjük és értékeljük. Ezeken a kvantitatív vonatkozásokon kívül a módszer minden esetben kvalitatív célokra is alkalmazható, amikor egyszerűen azt akarjuk kimutatni, hogy az antigén jelen van-e egy ismeretlen mintában. A szilárd fázisú hordozó előnyösen cellulózrészecskéket, poliakrilamidot, keresztkötéses dextránokat, szilikongumit, mikrokristályos üveget és műanyagot jelenthet, mégpedig előnyösen formázott anyagokat, így műanyagból - pl. polistirolból, polipropilénből vagy pdivinilkloridból - öntött csöveket, lapokat vagy mikrdemezeket. Előnyben részesítjük szilárd fázisú hordozóként a polivinü-mikrolemezeket. A találmány szerinti módszer kitüntetett alkalmazási tartománya 15-100 mg/ml antigén. Mint ez a szakember számára nyilvánvaló, ha a minták antigén-koncentrációja ezeken a határokon kívül helyezkedik el, a meghatá - rozandó mintákat előzetesen hígítani, vagy adott esetben töményíteni kell annak érdekében, hogy közelítően ezt az optimális koncentrációtartományt érjük el. A módszert a meghatározáson belüli és a két meghatározás közötti pontosság és az analitikai visszanyerés meghatározásával hitelesítjük. A meghatározáson belüli pontosság (CV) általában 4-8%, a két meghatározás közötti pontosság (CV) általában 7-23%, míg az analitikai visszanyerés 87-114%. Kimutattuk, hogy a találmány szerinti monoklonális antitest specifikus egy urokinázszerű plazminogén aktivátor prekurzor vonatkozásában is (ez egy egyiáncú prekurzor, amelyet humán epidermoid ráksejtek, az A431 sejtek termelnek, [ATCC CRL1555, Fabricant et al., Proc. Netl. Acad. Sei. 74, p. 565, (1977)] és a találmány szerinti eljárás alkalmazásával meghatároztuk a keletkezett prekurzort A találmány további illusztrálására a következő példákat mutatjuk be, amelyek nem tekinthetők a találmány oltalmi köre vonatkozásában korlátozó jellegűnek: 1. példa Az 5B4 anti-urokináz monoklonális antitest előállítása a) Az anti-urokináz monoklonális antitest előállítása 7 hetes nőnemű Balb/C egerek immunizálására nagy tisztaságú, 54000 dalton molekulatömegű urokinázt - 120000 IU/mg, (PERSOLVr RICHTER) - használunk fel. Ebből az urokinázból 10 pg-t komplett Freund-f. adjuvánsban oldva injektálunk az állatok hashártyájába, 60 nappal a fúzió előtt. 30 nap múlva további 10 pg urokinázt adagolunk az egerekbe. 10 nappal a fúziót megelőzően a szokásos ELISA-módszerrel mérjük az anti-urokináz antitest-szintet a farokvénákból vett vérmintákban. 5 nappal a fúzió előtt egy utolsó amlékeztető injekciót (10 pg) adunk i. v. azoknak az állatoknak, amelyek antitest-titere 1:10000-nél magasabb. Ezután a fúzió napián eltávolítjuk a lépet és a lépsejteket (kb. 1 x 10°) 5 x 107x63-Ag-8653 egér mielómasejttel 50%-os PEG 6000-ben fúziós reakcióba visszük. A fúzió megtörténte után - amelyet lényegében Milstein és Köhler módszerét követve hajtunk végre - a sejteket újra szuszpendáljuk Dulbecco-f. módosított Eagle-f. táptalajban (DMEM), amelyet 10% borjúembrió szérummal és HAT táptalajjal (0,1 mM hipoxantin, 0,25 mM aminopterin, 0,017 mM timidin, Flow Laboratories) egészítettünk ki és 5 különböző, a Costar cég által gyártott Costar lemezre visszük fel, amelyek egér makrofágokat (tápréteg) tartalmaznak. A HAT táptalajt 3 naponként cseréljük és a fúzió utáni 10. napon és ezt követően 2-3 naponként ELISA immunmeghatározási módszerrel megvizsgáljuk a felulúszó anti-urokináz monoklonális antitest tartalmát. b) Az anti-urokináz monoklonális antitest termelő hibridómák kiszűrése ELISA-módszerrel A Perlman-módszer egy módosított változatát követve (Immunochemistry 8, p. 873,1971) % helyes rugalmas mikrotitráló lemezeket (Dynatech) 50 pl/lyuk mennyiség alkalmazásával bevonunk egy oldattal, amely 20 pg/ml urokinázt tartalmaz pH 7,2 foszfát-pufferes sóoldatban, valamint pH 7 nátriumfoszfát oldattal, amely 0,5M nátriumkloridot tartalmaz, és a lemezeket 1 órán át szobahőmérsékleten inkubálják. Alapos mosás után - 0,05% Tween 20-at tartalmazó foszfát-pufferes sóoldattal - a lyukakba 3% szérumalbumint (szarvasmarha) tartalmazó foszfát-pufferes sóoldatot mérünk és a lemezeket 3 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk, a nem specifikus kötődés elkerülésére. Alapos mosás után 50 pl hibridóma tenyészet felülúszót (vagy ugyanüyen térfogatú aszcitesz folyadékot) adagolunk a lyukakba és 2 órán át szobahőmérsékleten lefolytatjuk a reakciót. A lemezeket ezután mossuk és 90 percen át szobahőmérsékleten inkubáljuk egy torma-peroxidázzal konjugáltnyúl-antiegérlg-ből(PI61,DAKO) készített 1:1000 hígítással. Alapos mosás után a lemezeket 200 pg/lyuk mennyiségben a kromogén oldatával kezeljük (SIGMA : 1 mg/ml o-fenüén-diamén pH 5,0,1M citrátpufferben, amely H202-ra 1,7M). A szín 20 perc alatt kifejlődik. Az optikai sűrűséget 492 nm-en olvassuk le olyan vakoldattal szemben, amely sem antigént, sem antitestet nem tartalmaz. Pozitívnek tekintjük azokat a lyukakat, amelyek folyadéka a vakoldathoz képest több, mint négyszeres színintenzitású. c) Az anti-urokinázt termelő hibridómák tömegtenyésztése Az anti-urokináz antitesteket termelő hibridómákat elkülönítjük, a hígítás korlátozása mellett klónozzuk, tömegtenyészetekben tenyésztjük és injekcióval bevisszük Balb/C egerek hashártyájába, amelyeket előzetesen 0,5 ml prisztánnalR (2,6,10,-14- tetrametil-pentadekán, Aldrich) kezeltünk. 15 nap elteltével összegyűjtjük az aszcitesz folyadékokat. Az anti-urokináz monoklonális antitestek koncent5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7
