203257. lajstromszámú szabadalom • Eljárás monoklonális anti-urokináz antitestek előállítására, valamint urokináz tisztítására és vizsgálatára
1 HU 203 257 B 2 vagy keresztreakcióba lépnének az urokináztól különböző szérum vagy vizelet endoproteázokkal; és a megfelelő mátrixhoz kötődve olyan immunadszorbens mátrixokat képesek eredményezni, amelyek kapacitása 150000 IU/ml-nél magasabb; képesek megkötni az antigént pH 4,5 és 8,0 között, még max. kb. 0,5M vizes nátriumklorid-oldatban is és a megkötött antitest pH 3,0-4,0 között 0,5-1M vizes nátriumklorid-oldattal leoldható. A találmány szerinti kitüntetett monoklonális antitest jelzése 5B4 és a következő jellemzőket mutatja: a) az IgG j osztályba tartozik; b) affinitási állandója kb. 1,42 x 107 mól-1 lényegében a Tsapis et al. által leírt eljárást (Eur. J. Biochem. 64, p. 369,1976) követve végezve a mérést; c) specifikusan az urokináz nagy molekulatömegű (54000) alakját vagy ennek prekurzorát köti meg anélkül, hogy az alacsony molekulatömegű (33 000) alakot vagy bármüyen szérum vagy vizeleteredetű tromboplasztinszerű urokinázszennyezést megkötne; d) megköti az A-lánc 18 000 molekulatömegű proteolízissel előállított fragmentjét, e) nem károsítja a deszorbeált urokináz enzimaktivitását; 0 izoelektromos pontja kb. 5,75. Jellegzetes mátrixok, amelyek alkalmasak a találmány szerinti monoklonális antitestekkel való kapcsolásra, a keresztkötéses dextrán és az ellenőrzött pórusú keresztkötéses dextrán, agaróz, a módosított és aktivált agaróz, pl. a karboximetfl-agaróz, a keresztkötéses agaróz N-hidroxi-szukcinimid-észter származékai, a cellulóz és a karboximetil-cellulóz. Ezek a mátrixok sok esetben a kereskedelemben hozzáférhetők akár aktivált, akár nem aktivált alakban. Az aktivált mátrixokat általában előnyben részesítjük, mivel, mint ismeretes, kezelésük a kapcsolási reakcióban előnyösen oldható meg. A találmány szerinti immunadszorbens elkészítése során a kitüntetett mátrix az aktivált agaróz. A találmány szerinti monoklonális antitestnek a mátrixhoz való kapcsolása ismert módon végezhető. Ha az alkalmazott mátrix nem aktivált, a kapcsolást előnyösen ismert aktiválószerek - pl. cianogén bromid, epiklórhidrin, l,4-bisz(2,3-diepoxi-propioxi)-bután vagy 3- amino-propü-trietoxi-szüán -segítségével végezzük. A találmány szerinti immunadszorbens egyik kitüntetett alkalmazási területe az 54000 molakulatömegű urokináz vagy prekurzora biológiai forrásokból kiinduló tisztítása, különösen az üzemi méretű tisztítás. Ezenkívül az immunadszorbens előnyösen alkalmazható analitikai teszt-rendszerekben, pl. radioimmun-vizsgálatokban, enzimekkel összefüggő immunvizsgálatokban és más ismert, kompetitiv kötődésen alapuló vizsgálatokban, az antigén iránti affinitása és a megkötött monoklonális antitest specificitása miatt. A találmány egy további tárgya: eljárás az 54000 molekulatömegű urokináz (HMW urokináz) vagy prekurzora biológiai anyagokból kiinduló tisztítására, amely abból áll, hogy egy biológiai forrást vagy ennek koncentrátumát érintkezésbe hozunk egy, a találmány szerinti immunadszorbenssel, pH 4,5-8,0 között, annak érdekében, hogy szelektíve megkössük az 54000 molekulatömegű urokinázt a találmány szerinti immunadszorbensen; a rendszert pH 6-8 között pufferolt oldattal öblítjük át és a megkötött antigént felszabadítjuk az immunadszorbensről, vizes oldattal - amely nátriumkloridra 0,5-lM-os - pH 3,0-4,0 között végezve az eluációt. Ebben az eljárásban az antigénnek az immunadszorbenshez való kötődése elérhető 0,5M-ig terjedő nátriumklorid koncentrációk mellett is, vizes oldatban, míg az antigén felszabadítása a komplex antigén/immunadszorbens rendszerből 0,5-lM nátriumklorid koncentrációk mellett - vizes oldatban - történhet. Mint ez a szakember számára ismert, a vizes nátriumklorid-oldat helyettesíthető bármely ekvivalens töménységű vizes oldattal, amely nem befolyásolja kedvezőtlenül a tisztítási eljárás menetét. A leírásban és az igénypontokban a „biológiai források” kifejezés körébe a következők tartoznak: biológiai folyadékot (pl. vizelet és vér), szövettenyészetek folyadékai és genetikai úton előállított olyan mikroorganizmusok fermentációs tenyészetei, amelyek képesek a találmány szerinti monoklonális antitest által felismerhető urokináz vagy plazminogén aktivátor termelésére. Mint már említettük, a találmány szerinti immunadszorbens képes az urokináz nagy molekulatömegű alakjának közvetlenül a biológiai forrásokból kiinduló tisztítására. Ha pl. a biológiai forrás emberi vizelet, a következő tulajdonságokkal rendelkező urokinázterméket kapunk: a) fibrinolitikus titere 130000 IU/ml-nél magasabb; b) nagy mennyiségben tartalmaz magas molekulatömegű urokinázt; c) gyakorlatüag mentes az alacsony molekulatömegű urokináztól; d) fibrinolitikus/észteráz aktivitásának aránya 2000- nél magasabb; e) gyakorlatüag mentes a tromboplasztinszerű szenynyezésektől (nulla koagulációs aktivitás kb. 200 IU/ml koncentrációknál). Bármely más biológiai forrásból kiindulva lényegében az előbbi jellemzőkkel rendelkező urokináztermékhez juthatunk. Az üzemi méretű tisztítás gyakorlatában egyes esetekben előnyös lehet a biológiai folyadék mint olyan helyett a biológiai folyadék koncentrátumának alkalmazása a találmány szerinti immunadszorbens segítségével végzett tisztítási folyamatban, annak érdekében, hogy csökkentsük az immunadszorbenssel érintkezésbe hozott (vagy az immunadszorbenst tartalmazó oszlopon átvezetett) folyadék térfogatát, következésképpen csökkentsük az egész művelet időtartamát és költségeit. A találmány szerinti immunadszorbens ebben az esetben is megőrzi hatékonyságát és a fenti jellemzőkkel rendelkező tisztított terméket eredményez. 5 10 16 20 25 30 36 40 45 50 55 60 5
