203257. lajstromszámú szabadalom • Eljárás monoklonális anti-urokináz antitestek előállítására, valamint urokináz tisztítására és vizsgálatára
1 HU 203 257 B 2 adjuvánsban alacsony dózisban viszünk be nagy tisztaságú, 54000 molekulatömegű urokinázt (120000 IU/mg, kb. 10 jog); másodszor 30 nappal a fúziót megelőzően ugyanezt a mennyiséget visszük be inkomplett Freund-f. adjuvánsban; végül, 5 nappal a fúzió előtt ugyanezzel a dózissal emlékeztető oltást adunk. A végső emlékeztető dózist csak azoknak az állatoknak adjuk be - és a továbbiakban csak azokkal foglalkozunk -, amelyek anti-urokináz antitest titere 10 nappal a fúzió előtt 1:10 000-nél magasabb. A lépeket eltávolítjuk és a lépsejteket kb. 108- 5 x 10'arány mellett fúziós reakcióba visszük mielóma sejtekkel. A fúzió után a sejteket megfelelő táptalajban - amilyen pl. a Dulbecco-f. módosított Eagletáptalaj: ez kb. 10% borjúembrió-szérumot tartalmaz - tenyésztjük és a fuzionált sejteket hipoxantin-aminopterin-timidin (HAT) táptalajon szelektáljuk. A sejttenyészetek felülúszóinak anti-urokináz antitest tartalmát ELISA módszerekkel határozzuk meg, amelyek „hagyományosan ” anti-urokináz antiszérum alkalmazását irányozzák elő. Az így azonosított antiurokináz monoklonális antitestek tisztítása ioncserélő kromatográfia vagy urokináz-agaróz oszlopon végzett affinitáskromatográfia segítségével történhet, míg a kapott termék homogenitásának értékelésére az elektroforézis a célszerű eszköz. Ezután értékeljük ezeknek az anti-urokináz monoklonális antitest készítményeknek az osztályspecificitását és az agarózon rögzített antigénre vonatkozó affinitási állandót. Az osztályspecificitást az Outcherlony-f. kettős immundiffúziós technikával határozzuk meg (Acta Pathol. Microbiol. Scand. 26, p. 507,1949); az affinitási állandót egyensúlyi megkötési vizsgálatokkal határozzuk meg, lényegében Tsapis et al. (Eur. J. Biochem. 64, p. 369,1976) módszere szerint. Ezekben a kísérletekben lényegében tiszta monoklonális antitesteket - amelyeket előzetesen pH 7,2-n foszfáttal puff erőit sóoldatban dializáltunk - növekvő koncentrációban felviszünk egy urokinázt tartalmazó mátrixra, pl. urokináz-agaróz mátrixra. A meg nem kötött antitest koncentrációját spektrofotometriásán határozzuk meg, a megkötött antitestek koncentrációját pedig a különbség alapján számítjuk ki a teljes beadagolt antitestmennyiség ismeretében. A kötődési adatokat ismert statisztikai módszerekkel dolgozzuk fel, amüyen pl. a G. Scatchard által leírt módszer (Ann. N. Y. Acad. Sei. 51, p. 660-672, 1949). A találmány szerinti monoklonális antitest affinitási állandója az előbbiekben leírt kísérletben (1,42 ± 1,5) x 107ljnól-1. A találmány tárgya: a találmány szerinti monoklonális antitesteknek az urokináz üzemi méretű tisztítására való felhasználása, egy immunadszorpciós rendszerben. A szakember számára nyüvánvaló, hogy egy üzemi méretű eljárásban való felhasználásra nem bármely monoklonális antitest alkalmas, amely egy adott antigén (a jelen esetben urokináz) ellen irányul. Ténylegesen ismeretes, hogy a „laboratóriumi” és az „üzemi” méretű műveletek között rendszerint szakadék tátong. A nagyságrendi változás ténylegesen jelentősen növeli a megoldandó problémák körét és számos esetben egy olyan megoldás, amely a laboratóriumi méretű művelet esetében megfelelő, nem alkalmas az üzemi méretű műveletben való alkalmazásra. A jelen esetben a megfelelő monoklonális antitestet az kell hogy jellemezze, hogy optimális affinitással rendelkezik az antigén iránt, annak érdekében, hogy hatékonyan kösse meg az antigént ilyen körülmények között. így lehetségessé válik a kötött antigén átöblítése anélkül, hogy lényeges leoldás következne be, és a mátrixról való eltávolítás lényegesen eltérő körülmények között végezhető. A leválasztás körülményeinek viszont eléggé enyhének kell lenniük annak érdekében, hogy elkerüljük akár az antigén, akár az immunadszorbens károsodását. Mivel bizonyos mértékben az antitest antigén iránti affinitása határozza meg a végső immunadszorbens kapacitását, az antitest iránti alacsony affinitás általában az immunadszorbens túlságosan alacsony kapacitásával jár együtt és ennek a következménye az alacsony tisztítási hatásfok (pl. mivel aktivitásvesztés következik be az átöblítés alatt). Ezzel szemben az antitest magas affinitása általában arra vezet, hogy az antigén túl erősen kötődik az immunadszorbenshez, és ennek a következménye az alacsony kitermelés, mivel pl. az eluálás nehézségekkel jár, vagy túlságosan drasztikus (és esetleg denaturáló) eluációs körülményeket kell alkalmazni A monoklonális antitest affinitási állandója és a megfelelő immunadszorbens kapacitása nem a kizárólagos kritikus paraméterek egy immunadszorpción alapuló üzemi méretű tisztítási eljárásban, mivel a monoklonális antitest szelektivitása ugyancsak nagyon fontos szerepet játszik ebben a folyamatban. A találmány szerinti monoklonális antitestek ténylegesen megkötik a nagy molekulatömegű urokinázt, de nem kötik meg az alacsony molekulatömegű alakot vagy bármely más, szérumban vagy vizeletben előforduló enzimesen aktív endopeptidáz-féleséget. Közelebbről: nem mutatnak keresztreakciót az ismert szérum- vagy vizeleteredetű tromboplasztinszerű szennyezésekkel. Ezenkívül a találmány szerinti monoklonális antitestek fenntartják specificitásukat a végső immunadszorbensben, a mátrixhoz kötődve is. Konkrétan: a találmány szerinti monoklonális antitestek - amelyekre az előbbiekben leírt specificitás jellemző -, mint már amlítettük, az előbbiekben leírt kísérletben (1,42 ± 1,5) x 1071 jnól-1 affinitási állandót mutatnak és a megfelelő mátrixhoz kapcsolva olyan immunadszorbenst eredményeznek, amelynek kapacitása 150 000 IU/ml-nél magasabb. A találmány szerinti monoklonális antitestek tehát IgGj típusú anyagok; affinitási állandójuk kb. (1,42±l,5)x 107ljnól-1 az előbbiekben leírt kísérletben (amely rögzített urokinázt alkalmaz); jó a specificitásuk az urokináz nagy molekulatömegű alakja vagy ennek egyláncú prekurzora iránt, anélkül hogy kötődnének az alacsony molekulatömegű alakhoz 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
