203257. lajstromszámú szabadalom • Eljárás monoklonális anti-urokináz antitestek előállítására, valamint urokináz tisztítására és vizsgálatára
1 HU 203 257 B 2 dal, a 2. ábrához fűzött megjegyzések 2. szakasza) nem alkalmas az ipari léptékű tisztításra. Ezek a szerzők továbbá rámutatnak arra, hogy az urokináz monoklonális antitest immunadszorbens alkalmazásával történő üzemi méretű tisztításának problémáját még meg kell oldani. („Ennek az affinitástechnikának a nagyüzemi alkalmazhatóságát azonban még igazolni kell”: 27. oldal, bal oldali oszlop, 13-14. sor). A 84 344. sz. közzétett európai szabadalmi bejelentés nagy vonalakban ír le egyes anti-urokináz monok - lonális antitesteket. Ezek állítólag felhasználhatók, az urokináz tisztítására, valamint diagnosztikai és analitikai célokra. Az urokináz végterméket azonban nem jellemzik, sem a magas, ill. alacsony molekulatömegű alak mennyiségét, sem a biológiailag aktív anyag vagy a toxikus szennyezések mennyiségét illetően. G. Salerno et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. 81, p. 110-114,1984) más anti-urokináz monoklonális antitesteket ír le, amelyek - mint erre az alábbiakban rámutatunk - megkötik az urokináznak mind a magas, mind az alacsony molekulatömegű alakját és olyan affinitási állandóval rendelkeznek, hogy az nem megfelelő a hatékony affinitáskromatográfiához. Más, „anti-urokináz” monoklonális antitesteket tartalmazó immunad - szorbenseket ír le L. S. Nielsen et al. - Biochemistry 21, p. 6410-6415, 1982 - és K. Kaltoft et al. - Proc. Natl. Acad. Sei. 79, p. 3720-3723,1982). A leírt monoklonális antitestek gátolják a plazminogén - ezt a szerzők HPA 52-nek nevezik - enzimaktivitását. A mátrixhoz -1 ml mátrixra számítva - kötődő antitest mennyisége és a végső módosított mátrix kapacitása azonban nem megfelelő az ipari léptékű alkalmazásra. Ezenkívül 2 egymásutáni kromatográfiás lépésre van szükség a HPA 52 tisztításához, glioblasztóma sejttenyészetből kiindulva (I. táblázat, p. 6412). A találmány szerinti eljárással a következő jellemzőkkel rendelkező anti-(humán urokináz) monoklonális antitest állítható elő: a) IgGt típusú; b) affinitási állandója (1,42 ± 1,5) x 107lmól-1 az immobflizált urokinázra vonatkoztatva, a meghatározás során, lényegében a Tsapis et al. által leírt (Eur. J. Biochem. 64, p. 369,1976) eljárást követve; c) kötődik a nagy molekulatömegű (54000) urokinázhoz vagy ennek egyláncú prekurzorához anélkül, hogy megkötné az alacsony molekulatömegű (33 000) urokinázt; d) kötődik az A-láncból proteolízissel előállított 18 000 molekulatömegű fragmentumhoz; e) nem lép keresztreakcióba a szérum vagy a vizelet urokináztól különböző enzimaktivitást mutató endopeptidázaival. Tekintettel a találmány szerinti monoklonális antitestek azon jellemzőjére, hogy egyaránt kötődnek a magas molekulatömegű urokinázhoz és az urokináz prekurzorhoz, a leírás további részeiben és az igénypontokban, amikor a találmány szerinti monoklonális antitestek fajlagosságával és kötő tulajdonságaival foglalkozunk, az „urokináz” kifejezést abban az értelemben használjuk, hogy az magában foglalja mind az urokináz nagy molekulatömegű alakját, mind az urokináz prekurzort. Ugyanüyen szövegkörnyezetben az „urokináz nagy molekulatömegű alakjára” való hivatkozást úgy kell érteni, hogy az magában foglalja prekurzorait is, amelyeket hasonlóképpen megkötnek a találmány szerinti monoklonális antitestek. A leírásban és az igénypontokban az „urokináz prekurzor” kifejezés a „természetes” egyláncú urokináz prekurzorokra vonatkozik - amilyen az előbbiekben említett urokináz zimogén -, valamint a rec-DNS- technikákkal előállított urokináz prekurzorokra vagy hasonló anyagokra, amelyek közös tulajdonsága az, hogy megkötik a találmány szerinti monoklonális antitesteket. A találmány szerinti anti-urokináz monoklonális antitesteket szomatikus sejtfúzióval állítjuk elő „nem kiválasztó” típusú egér mielóma sejtekből (ezek olyan mielóma sejtek, amelyek nem választanak ki immunglobulinokat) és urokinázzal előzetesen immunizált egerek lépsejt jelből. Röviden: Balb/c egereket nagy tisztaságú, 54000 molekulatömegű urokinázzal immunizálunk és az eltávolított lépsejteket fúzióba visszük nem kiválasztó mielóma sejtekkel. Ez utóbbiak bizonyos genetikai hibákkal jellemezhetők, amelyek képtelenné teszik őket arra, hogy egy bizonyos közegben - amely nagyon hasznos lesz a hibridsejtek későbbi izolálásához - fennmaradjanak. Ilyen sejtvonal pl. az X63-Ag8653 jelű, amelyet Kearney et al. írt le (J. ImmunoL 123, p. 1548-1550, 1979), ATCC száma ATCC CCL 61 (CHO KI törzs) és amely a szakember által ismert és hozzáférhető. Az Uyen mielóma sejtek a köz számára általában hozzáférhetők, számos tudományos intézmény segítségével, amüyen pl. a Salk Intézet (Cell Distribution Center, P. O. Box 1809, San Diego, California 92112) vagy az Orvosi Kísérleti intézet (NIGMS Cell Repository, Copewood and Davis Streets, Camden, New Jersey 08103). A sejtfúziót polietflénglikol, előnyösen polietilénglikol (PEG) 6000jelenlétében hajtjuk végre. A nagy tisztaságú, 54 000 molekulatömegű urokináz (HMW urokináz) több forrásból is hozzáférhető a kereskedelemben. Egy megfelelő nagy tisztaságú urokinázkészítmény a következőkkel jellemezhető: nemzetközi egységekben (IU) kifejezve magas titer, magas fibrinolitikus/eszterolitikus aktivitás arány és a trórnboplasztin típusú szennyezésének nagyon alacsony koncentrációja vagy gyakorlati hiánya. Előnyben részesített nagy tisztaságú urokinázkészítmény a kereskedelemben PERSOLVr kereskedelmi névvel forgalmazott tennék (Gruppo Lepetit SPA), amelynek fibrinolitikus aktivitása 100000 IU/mg fölötti, a fibrinolitikus/eszterolitikus aktivitás aránya 1,4-nél magasabb, nyulakban 20000 IU/kg feletti dózisokban apirogén és 200 IU/ml plazmakoncentrációk mellett is nulla a koagulációs aktivitása. Az immunizálási lépést előnyösen az urokináz alacsony dózisban való bevitele jellemzi. Egy tipikus án - munizálási eljárás egerekben a következő fázisokból áll: először, 60 nappal a fúzió előtt komplett Freund-f. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
