203257. lajstromszámú szabadalom • Eljárás monoklonális anti-urokináz antitestek előállítására, valamint urokináz tisztítására és vizsgálatára
1 HU 203 257 B 2 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás monoklonális egér anti-humán -urokináz antitest-képző hibridómák előállítására - amelyek képesek, tenyésztés során, az alábbi tulajdonságokkal rendelkező anti-humán-urokináz antitest képzésére: a) IgGj osztályba tartozik, b) affinitási állandója (1,42±0,71)x 107ljnól-1 rögzített humán urokinázra vonatkoztatva, a mérést lényegében Tsapis és munkatársai eljárása szerint (Eur. J. Biocbem. 64, p. 369,1976) végezve, c) kötődik a nagy molekulatömegű (54000) urokinázhoz és/vagy ennek egyláncú prekurzorához anélkül, hogy kötődne a kis molekula tömegű (33 000) urokinázhoz, d) megköti az urokináz A-láncának 18 000 molekulatömegű proteolítikus fragmentumát, e) az urokináz kivételével nem lép keresztreakcióba a szérumban vagy a vizeletben található enzimatikuson aktív endopeptidázokkal -, azzal jellemezve, hogy egy 54 000 molekulatömegű humán urokinázzal immunizált egérből vett limfocitákkal és ugyanezen állatfaj mielóma sejtjeivel szomatikus fúziót hajtunk végre, és a keresett anyagot termelő hibridómákat enzimes immunmeghatározás segítségével kiszűrjük a termelt antitest osztály specificitásának, affinitási állandójának és antigén specificitásának meghatározása mellett. (Elsőbbsége: 1984.08.31.) 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy limfocitaként egér lépsejteket és mielóma sejtként egér mielóma sejteket alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1985.04.26.) 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mielómasejtként X63-Ag 8653 egér mielómasejteket (ATCC CCL61) alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1984.08.31.) 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fúziót polietüénglikol jelenlétében hajtjuk végre. (Elsőbbsége: 1984.08.31.) 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fúziót 6000 molekulatömegű polietilénglikol (PEG 6000) jelenlétében hajtjuk végre. (Elsőbbsége: 1985.04.26.) 6. Eljárás az alábbi tulajdonságokkal rendelkező monoklonális egér anti-humán-urokináz antitest előállítására: a) IgGj osztályba tartozik, b) affinitási állandója (1,42±0,71) x 1071 jnól-1 rögzített humán urokinázra vonatkoztatva, a mérést lényegében Tsapis és munkatársai eljárása szerint (Eur. J. Biochem. 64. p. 369,1976) végezve, c) kötődik a nagy molekulatömegű (54 000) urokinázhoz és/vagy ennek egyláncú prekurzorához anélkül, hogy kötődne a kis molekulatömegű (33 000) urokinázhoz, d) megköti az urokináz A-láncának 18000 molekulatömegű proteolítikus fragmentumát, e) az urokináz kivételével nem lép keresztreakcióba a szérumban vagy a vizeletben található enzimatikusan aktív endopeptidázokkal, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti eljárással előállított hibridómát egy megfelelő gazdaszervezetben vagy táptalajban tenyésztjük és az antitestet kinyerjük. (Elsőbbsége: 1984.08.31.) 7. A 6. igénypont szerinti eljárás olyan humán monoklonális anti-urokináz antitest előállítására, amelynek izoelektromos pontja 5,75, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti eljárással előállított hibridómát egy megfelelő gazdaszervezetben vagy táptalaiban tenyésztjük és az antitestet kinyerjük. (Elsőbbsége: 1984.08.31.) 8. Eljárás az 54 000 molekula tömegű urokináz vagy egyláncú prekurzora biológiai forrásokból kiinduló tisztítására, azzal jellemezve, hogy a biológiai forrást vagy koncentrátumát érintkezésbe hozzuk egy immunadszorbenssel - amelyet úgy állítunk elő, hogy egy, a következő tulajdonságokkal rendelkező egér anti-humán-urokináz antitestet: a) IgGj osztályba tartozik, b) affinitási áüandója (1,42 ±0,71) x 1071 jnól-1 rögzített humán urokinázra vonatkoztatva, a mérést lényegében Tsapis és munkatársai eljárása szerint (Eur. J. Biochem 64, p, 369.1976) végezve, c) kötődik a nagy molekulatömegű (54 000) urokinázhoz és/vagy ennek egyláncú prekurzorához anélkül, hogy kötődne a kis molekulatömegű (33 000) urokinázhoz, d) megköti az urokináz A-láncának 18 000 molekulatömegű proteolitikus fragmentumát, e) az urokináz kivételével nem lép keresztreakcióba a szérumban vagy a vizeletben található enzimatikusan aktív endopeptidázokkal -, hozzákapcsolunk agaróz vagy módosított vagy aktivált agaróz, keresztkötésű dextrán, cellulóz vagy karboximetil-cellulóz mátrixhoz pH 4,5-8,0 között, a rendszert pH 6-8 közötti pufferoldattal öblítjük át és a megkötött antigént leoldjuk az immunadszorbensről egy olyan oldattal való eluálással, amely előnyösen 0,5-1 mól/1 nátriumkloridot tartalmazó 3,0-4,0 pH értékű vizes oldat. (Elsőbbsége: 1984.08.31.) 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az antigénnek az immunadszorbenshez való kötését max. 0,5 mól/1 nátriumkloridot tartalmazó vizes oldatban végezzük (Elsőbbsége: 1984.08.31.) 10. A 8. igénypont szerinti eljárás a következő tulajdonságokkal rendelkező urokináz tisztítására: a) fibrinolitikus titere 130 000 IU/mg-nál magasabb, b) nagy mennyiségben tartalmazza a nagy molekulatömegű urokinázt vagy egyláncú prekurzorát, c) gyakorlatüag nem tartalmazza a kis molekulatömegű urokinázt, d) s fibrinolitikus/észteráz aktivitás aránya 2000-nél magasabb, e) gyakorlatüag nem tartalmaz tromboplasztinszerű szennyezéseket (nulla koagulációs aktivitás 200 IU/ml koncentrációban), azzal jellemezve, hogy a tisztítási eljárást a megfelelő biológiai forrásból kiindulva végezzük. (Elsőbbsége: 1984.08.31.) 11. A 8. igénypont szerinti eljárás a következő tulaj-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 12
