203257. lajstromszámú szabadalom • Eljárás monoklonális anti-urokináz antitestek előállítására, valamint urokináz tisztítására és vizsgálatára
1 HU 203 257 B 2 A találmány tárgya eljárás új típusú IgG ] monoklonális antitestek előállítására, amely a humán urokináz egy külső pontjára irányul, szelektíve kötődik a nagy molekulatömegű (54000) urokinázhoz, vagy annak egyláncú prekurzorához anélkül, hogy a kis molekulatömegű (33 000) urokinázhoz kötődne; urokinázra vonatkozó affinitás! állandója alapján alkalmas egy immunadszorpción alapuló tisztítási eljárásban való felhasználásra, mely tisztítási eljárás szintén a találmány tárgya. A szóban forgó antitest nem károsítja az urokináz enzimaktivitását. A találmány szerinti eljárással előállított monoklonális antitestek megfelelő mátrixhoz kapcsolva immunadszorbens mátrixot szolgáltatnak, amely alkalmas a biológiai kiindulási anyagokban jelen levő emberi urokináz vagy egyláncú prekurzora tisztítására. Ezek az immunadszorbens anyagok - az antitest antigénje iránti optimális affinitása miatt - különösen alkalmasak ipari méretekben is a humán urokináz vagy egyláncú prekurzora tisztítására. A találmány tárgya továbbá vizsgálati módszer, mely a monoklonális antitestek felhasználásával nagy molekulatömegű humán urokináz (HMW-urokináz) vagy egy egyláncú prekurzora kimutatására irányul. A humán urokináz egy ismert plazminogén aktivátor (PA), amely főként a vesesejtekben képződik. Fontosabb fiziológiai szerepe láthatóan az, hogy aktiválja a fibrinolitikus rendszert. Az urokináz ezért ajánlható egyes akut érrendszeri rendellenességek kezelésére, amilyen pl. a szívizominfarktus, szélütés, tödőembólia, mélyvénás trombózis, perifériás érelzáródás, vérzések és vénaelzáródás a retinán. A plazminogén aktivátorok (PA) olyan szerin proteázok, amelyek a plazminogént plazminná alakítják át. A plazmin egy proetáz, amelyet magas fokú fajlagosság jellemez a fibrin iránt (ez a vérrögök alapvető öszszetevője). Tenyésztett rosszindulatú sejtvonalakból legalább 2, immunológiailag különböző típusú PA-t izoláltak. Az egyik típus hasonló a szöveti plazminogén aktivátorhoz (TPA) - D. C. Rijken et al., Biochim. Biophys. Acta 380, p. 140, 1979 -, a másik pedig a vizeletben előforduló aktivátorhoz (UPA), amelyet urokináznak is neveznek (J. R. B. Williams, Br. J. Exp. Pathol. 32, p. 530,1951). Az urokináz típusút, amelyet eredetüeg kétláncú proteinként állították elő, vizeletből kiinduló tisztítással, újabban (pro-urokináznak nevezett) proenzim alakban különítették el, pl. a HEp3 humán epidermoid ráksejtvonalból (T. D. Wunt et al., J. Bioi. Chem. 257, p. 7262,1982), humán glioblasztóma sejtekből (L.-S. Nielsen et. al. Biochem. 21, p. 6410,1982), vizeletből (S. C. Husain et al., Arch. Biochem. Biophys. 220, p. 31, 1983) és az emberi veséből származó TCL-598 állandó sejtvonalból (T. Kohno et al., Biatechnol. 2, p. 628). Újabban az A431 humán epidermoid ráksejtvonal felülúszójából azonosítottak egy, az urokinázzal immunológiai szempontból rokon proenzimet. Ez a pro-urokináz zimogén egy egyláncú protein, molekula tömege 50-54000; amidáz aktivitása nincs vagy alacsony és fibrin-affinitása magas; ellenálló a diizopropil-fluorfoszfát kezeléssel és a plazma inhibitorokkal történő inaktiválással szemben (I. Gurewich et al., J. Clin. Invest. 73, p. 1731,1984) és plazminnal végzett kezeléssel átalakítható a kétláncú aktív enzimmé, az urokinázzá. A humán urokinázmolekulát számos, biológiailag aktív alakban különítették el. Általában azonban azzal jellemezhető, hogy egy magas (kb. 54 000) és egy alacsony (kb. 33 000) molekulatömegű részből áll. Az alacsony molekulatömegű alak (LMW) enzimes bontással állítható elő a nagy molekulatömegű (HMW) alakból. A HMW alak egy 30000 molekulatömegű nehéz láncból (B-lánc) és egy kb. 2000 molekulatömegű rövid láncból (A-lánc) áll, amelyeket diszulfidkötés köt össze. Az LMW alak a teljes B-lánccal azonos; ez tartalmazza az aktív helyet és egy kis, a proteolízisnek ellenálló fragmentumot (molekulatömeg 2,427), amely a diszulfid kötéssel összekötött A-láncból vezethető le. Az A-lánc proteolízissel két fragmentumra bontható fel: egy 18000 molekulatömegű fragmentumra és az előbbi 2472 molekulatömegűre. Úgy tűnik, hogy az LMW urokináz a HMW urokináznál kevésbé aktív, a vérrög in vivo lízisének gyorsításában. (M. Samama et al., Thromb. Haemost. 40, 578-580, 1979, G. Murano et al., Blood 55, p. 430-436,1980). A humán urokinázt jelenleg főként biológiai anyagokból - pl. emberi vizeletből, szövettenyészetekből, különösen normális és rákos vesesejt-tenyészetekből - állítják elő a szokásos tisztítási eljárások segítségével. A humán urokinázzimogén hasonló fiziológiai szerepet játszhat, mihelyt aktiválás folytán urokinázzá alakul. Újabban leírták, hogy a humán urokinázt DNS-technológiával állítják elő (92182 sz. közzétett európai szabadalmi bejelentés). C. Milstein és G. Köhler monoklonális antitest-képző sejthibridekre vonatkozó úttörő munkáját - amelyet a Nature 256, p. 495-497,1975 helyén írtak le - követően a szakirodalomban megjelentek az urokináz elleni monoklonális antitestek. Pl. a 896253 sz. belga szabadalmi leírás többféle monoklonális antitestet tárgyal, amelyeket úgy állítanak elő, hogy egereket kis molekulatömegű urokinázzal (33 000) immunizálnak Ezek a monoklonális antitestek nyüvánvalóan egy, az urokináz kis molekulatömegű alakján jelen levő külső pont ellen irányulnak. Az egyik ilyen - AAU2 jelzéssel eUátott - antitestet izolálták és az urokináz tisztítására használták fel (P. Herion, A Bollen, Bioscience Reports 3, p. 373-379, 1983). A kapott urokináz természetesen mind az alacsony, mind a magas molekulatömegű anyagot kell hogy tartalmazza. D. Vetterlein és G. J. Colton (Thromb. Haemostas, Stuttgart, 49, p. 24- 27, 1983) leírja az urokináz tisztítását, amelynek során a könnyű urokinázlánccal szembeni, rögzített monoklonális antitesteket alkalmaznak. A leírt tisztítási tényező 2,4-nél kisebb (60000-70000 CTA egység/mg értékről 142000-167000 CTA egység/mg értékre, 1. 25. oldal, jobb oldali oszlop, 10-11. sor). A leírt kísérletben a vizelettel az immunadszorbenshez kötött urokináz (300 ml vizelet/1 ml gyanta, 1. 26. ol6 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
