203256. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a kammunocin nevű új antibiotikum, és hatóanyagként e vegyületet tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 203 256 B 2 lat/perc keverés mellett, 6-7 liter/perc levegőztetést alkalmazva 24 órán keresztül végezzük. Az így kapott jól szaporodó, második átoltású oltó-tenyészetet használjuk az antibiotikum előállítására használt tápközeg beoltására. Antibiotikum előállítására használt tápközeg összetétele glükóz 15,0 g oldható keményítő 20,0 g szójaton (szójaliszt enzimatikus hidrolizá túrna) 3,0 g pepton 3,0 g CaC03 2,0 g NaCl 2,0 g kukoricalekvár 2,0 g (NH4)2S04 0,5 g desztillált víz 1 liter pH 6,5 A fermentorba 0,025% Desmophent teszünk, habzásgátló szerként. A fenti összetételű tápközeg 280 literét 390 literes fennen toredénybe mérjük. A tápközeget 121 °C-on 28 percen keresztül sterilezzük közvetett vagy közvetlen gőzzel. A fermentoredényt lehűlni hagyjuk, és 7 térfogat% második átoltású oltó-tenyészettel beoltjuk. A fermentálást 27±l°C-on 100-120 fordulat/perc keverés mellett végezzük, a levegőztetés 170 liter percenként. A fermentálást 40-45 óra múlva fejezzük be, ekkor a tenyészet szűrletének gátlózóna-átmérője Staphylococcus aureus 209 P ellen 20 mm, agar-lyukasztásos módszert alkalmazva (6 mm lyukátmérő), 30 mmól kalciummal kiegészített agaron, a tápfolyadék pH-jának 6,5-6,9 értéke mellett. A leülepedett sejttérfogat 20%. Az antibiotikum-komplexet tartalmazó tenyészlevet összegyűjtjük és a micélium elválasztása céljából centrifugáljuk, majd a 4. példában ismertetett módon feldolgozzuk. 3. példa Streptomyces Y-84,36210 tenyésztése kammunocin előállítása céljából A 2. példában leírtak szerint járunk el, az alábbi körülmények között. A Streptomyces Y-84,36210 törzset az alábbi öszszetételű agaros tápközegben tenyésztjük oldható keményítő 10,Og k2hpo4 l,0g MgS047H20 l,0g NaCl l,0g (NH^SC^ 2,0 g CaC03 2,0 g FeS047H20 0,1 mg MoCl24H20 0,1 mg ZnS047H20 0,1 mg desztillált víz 1 liter pH 7,2 Az oltó-tápközeg összetétele azonos a 2. példában ismertetett oltó-tápközegével. Fermentációs tápközeg összetétele: glükóz 20,0 g szójababliszt 10,0 g CaCÖ3 0,2g CoC126H20 1,0 mg desztillált víz 1 liter PH 7,0 100 liter fenti tápközeget 1501-es fermentoredénybe helyezünk. A tápközeget 121 °C-on 28 percen keresztül közvetett vagy közvetlen gőzzel sterilezzük A fermentoredényt lehűtjük és 9 térfogat% második átoltású oltótenyészettel beoltjuk. A fermentálást 27 ± 1 °C-on, 80-90 fordulat/perc keverés és 60-70 liter/perc levegőztetés mellett 40-45 órán keresztül végezzük A fermentálás végén a tenyészlé pH-ja 6,45 és a Staphylococcus aureus 209 P elleni gátlózóna átmérője 22 mm, a tenyészet szűrletét agarlyukasztásos módszerrel (6 mm lyukátmérő) vizsgálva, 30 mmól kalciummal kiegészített agart használva. A leülepedett sejttérfogat 12 térfogat%. A tenyészlevet az 5. példában leírtak szerint dolgozzuk fel. 4. példa 240 ml 2. példa szerint előállított tenyészszűrletet 6 liter anioncserélő Amberlite® IRA 68 (Cl-) gyantát (polisztirol-poliamin funkcionalitású ioncserélő gyanta) tartalmazó oszlopra viszünk Az oszlopot 40 liter sómentesített vízzel öblítjük majd 2,0 mól/1 koncentrációjú, ammóniával pH 8,5 értékre állított nátrium-klorid-oldattal eluáljuk Az így kapott aktív eluátumokat (30 liter) etü-acetát és n-propanol 2:1 térfogatarányú elegyével háromszor extraháljuk majd a pH-t sósavval 4,0 értékre állítjuk Az extraktumot vákuumban bepároljuk, és az így kapott 6,1 g koncéntrátumot szilikagéllel (szitaméret 0,062-0,037 mm, 600 g) töltött oszlopon kromatográfiás eljárással tisztítjuk az eluálást kloroformtól kloroform-metanol 1:1 térfogatarányú elegyéig változó gradienssel végezzük Az egyesített aktív frakciókat (3 g) telített, vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal extraháljuk majd az extraktum pH-ját sósavval 4,0-ra állítjuk, és etü-acetát és n-propanol 2:1 térfogatarányú elegyével újraextraháljuk. Az extraktumot vákuumban koncentráljuk, és a kapott 1,8 g anyagot 360 g szilikagéllel (szitaméret 0,062-0,037 mm) töltött oszlopon kromatografáljuk Az eluálást etü-acetáttól etü-acetát-metanol 1:1 térfogatarányú elegyéig változó koncentráció-gradienssel végezzük Bepárlással 860 mg biológiailag aktív anyagot kapunk A kapott anyagot 6 részre osztjuk, és külön-külön metanolban 50 g Sephadex®LH-20-at (lipofü gélszűrő anyag) tartalmazó oszlopra visszük az eluálást matanoüal végezzük A fenti módon 360 mg kammunocint kapunk, amelynek fizikai áüandóit a 6. példában ismertetjük 5. példa A 3. példa szerint végrehajtott két párhuzamos fermentálásból nyert tenyészet szűrletét egyesítjük, így összesen 185 liter szűrletet kapunk A fenti szűrletet 4 6 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7
