203256. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a kammunocin nevű új antibiotikum, és hatóanyagként e vegyületet tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 203 256 B 2 liter Amberlite® IRA 68-at (Cl-) tartalmazó oszlopra visszük fel. A oszlopot 20 liter sómentesített vízzel mossuk, és 2,0 mól/1 koncentrációjú vizes nátriumklorid-oldattal eluáljuk, amelynek pH-ját ammóniával 8,5-re állítottuk. Az így kapott 47 liter gktív eluátumot 3 liter Diaion® HP-20-at (polimer adszorbens, Mitsubishi Chemical Indrustries, Japán) tartalmazó oszlopra visszük fel; az oszlopot 7 liter sómentesített vízzel mossuk, és metanollal eluáljuk. Az aktív metanolos eluátumokat vákuumban koncentráljuk, és az így kapott vizes oldatot desztillált vízzel hígítjuk. A pH-t sósavval 3,0-ra állítjuk, és az oldatot Diaion HP-20-szal töltött oszlopra visszük. Az oszlopot sómentesített vízzel addig öblítjük, míg az öblítővíz kloridiontól mentes lesz. A kammunocint metanollal eluáljuk; a metanolos eluátumot vákuumban koncentráljuk és liofilizáljuk. A fenti módon 21 g nyers antibiotikum-komplexet kapunk. A kapott nyersterméket kétszer desztillált vízben oldjuk, amelynek pH-ját ammóniával 1,7-re állítottuk, az oldatot két részre osztjuk, és két, a Sephadex® LH-20-at kétszer desztillált vízben tartalmazó, 6.4 x 84 cm-es oszlopra visszük fel. Az oszlopokat 0,5 ml/perc átfolyási sebesség mellett kétszer desztillált vízzel eluáljuk, és az eluátumot 20 ml-es frakciókban gyűjtjük. Az így kapott, összesen 1,1 liter aktív eluátumot liofilizáljuk, így 8 g antibiotikum-komplexet kapunk. A kapott anyagot Sephadex® LH-20-at tartalmazó oszlopon újrakromatografálva továbbtisztítjuk a fent ismertetett módon, így 4,45 g félig tiszta antibiotikum-komplexet kapunk. A fenti félig tisztított komplexet 200 ml kétszer desztillált vízben feloldjuk, és 6 x 26 cm-es, DEAE SephadexR A-25-tel (ioncserélő gyanta dietü-aminoetü-funkcionalitással) töltött oszlopon (kétszer desztillált vízben) kromatografáljuk. Az oszlopot vízzel öblítjük, majd vizes nátrium-klorid-oldattal eluáljuk, amelynek moláris koncentrációját 5%-onként lépcsőzetesen növeljük. Az antibiotikum-komplexet 6 liter 1.5 mól/1 koncentrációjú nátrium-klorid-oldattal, majd 5 liter 2 mól/1 koncentrációjú nátrium-klorid-oldattal eluáljuk. Az egyesített eluátumok pH-ját sósavval 2,0-re áüítjuk, majd 2 liter Diaion® HP-20-at tartalmazó oszlopra visszük; az oszlopot vízzel addig öblítjük, míg az öblítővíz kloridion-mentes lesz. Az oszlopot ezután metanollal eluáljuk A metanolt vákuumban ledesztilláljuk, és a maradékként kapott vizes oldatot liofilizáljuk. 700 mg tiszta kammunocint kapunk, amelynek fizikai állandóit a 6. példában ismertetjük. 6. példa A tiszta kammunocin antibiotikum-komplex nagynyomású folyadékkromatogramja ODS-Hypersü -t (10 |x) tartalmazó, 4x120 mm nagyságú oszlopon, metanol és 1%-os vizes ecetsav 55:45 térfogatarányú elegyéből álló eluálószerrel, 0,5 ml/perc átfolyási sebesség mellett, 234 nm-en vizsgálva azt mutatja, hogy a kammunocin egy mikroheterogén keverék, azaz egymással rokon antibiotikus tulajdonságú vegyületek komplexe, amint az a 2. ábrán látható. A kammunocint 6 n sósavoldattal hidrolizáljuk, és az így kapott hidrolizátumot metüezés és trifluor-acetüezés után GC-EIMS (gázkromatográfiás elektronküökéses tömegspektroszkópia) és GC-CIMS (gázkromatográfiás tömegspektroszkópia) kémiai ionizálással) módszerrel analizáljuk, 3% OV-l-et tartalmazó gázkromon-Q-oszloppal ellátott Perkin-Elmer gázkromatográf segítségével, amelyhez on-line Datasystem DS-50 SM-mel ellátott AEI MS-9025 tömegspektrométert kapcsolunk. A következő aminosavak jelenlétét mutattuk ki: Fő komponensek; a-amino-adipinsav aszparag insav glicin 4-hidroxi-fenüglicin szerin Mellékkomponensek: glutaminsav 3-hidroxi-aszparaginsav leucin N-metilfenü-glicin prolin treonin. A fenti adatokból arra következtethetünk, hogy a kammunocin egy peptid-antibiotikum-komplex. A komplex fő komponensének móltömege 1516 (FAB-MS mérés szerint). A fő komponens kvantitatív aminosav-analízisének eredményei: a-amino-adipinsav: glicin :4-hidroxi-fenü-glicm: sze rin: treonin: aszparaginsav = 1:1:1:1:1:3; UV- és IR-spektruma a fent megadott; az antibiotikus aktivitás kifejtéséhez szükséges, 30 mmól/l-nél nagyobb Ca2+-igény egyedülálló, egyetlen ismert antibiotikumnál sem figyelhető meg. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás kammunocin - amelynek UV-spektruma metanolban a 3. ábra szerinti, abszorpciós sávjai 224, 280 és 345 nm körül vannak; IR-spektruma Kbr-tablettéban a 4. ábra szerinti, abszorpciós sávjai 3400, 1680, 1559, 1250 és 600 cm-1 körül vannak - előállítására, azzal jellemezve, hogy a Streptomyces Y- 84,36210 (deponálási szám: DSM 4329) törzset vagy annak egy variánsát vagy mutánsát aerob körülmények között, szén- és nitrogénforrást, valamint tápsókat és adott esetben nyomelemeket tartalmazó tápközegben tenyésztjük, és a kammunocint a tenyészléböl izoláljuk és tisztítjuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tenyésztést 18 és 37 °C közötti hőmérséklettartományban, 6 és 9 közötti pH-értéken végezzük. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tenyésztést 26 és 28 °C közötti hőmérséklet-tartományban, 6,4 és 6,6 közötti pH-értéken végezzük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 8
