203256. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a kammunocin nevű új antibiotikum, és hatóanyagként e vegyületet tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 203 256 B 2 szőr az anioncserélőn adszorbeáljuk, majd megfelelő mozgó fázist - például vizes vagy metanolos nátriumvagy kálium-klorid-oldatot, híg sósavoldatot vagy nátrium-hidroxid-oldatot - alkalmazva eluáljuk, eluensként előnyösen 2 mól/1 koncentrációjú nátrium-klorid- 5 oldatot használunk. A hatóanyagot tartalmazó eluátumot koncentráljuk, és a fent említett adszorbensek segítségével sómentesítjük. Az így nyert, sómentes aktív eluátumot összegyűjtjük és koncentráljuk. A fenti módon kapott, koncentrált, kammunocin- 10 tartalmú eluátumot ezután különféle módszerekkel tovább tisztíthatjuk. Például további adszorpciót és eluciót alkalmazhatunk, aktív szénen, polimer adszorbenseken - például Amberlite® XAD-4-en (polisztirolból álló polimer mátrixból áll, átlagos pórusátmérő- 15 je 40 x 10“10 m), Amberlite XAD 7-en (akrüészter mátrixból áll, átlagos pórusátmérője 40 x 10~10 m, Rohm and Haas Co., USA), Diaion® HP-20-on (Mitsubishi Indrustries, Japán) - adszorbeálva, vagy lipofü gélszürő anyagokon - például Sephadex® LH-20-on 20 vagy a G-sorozatba tartozó géleken (Pharmacia Fine Chemicals AB, Svédország) és hasonló termékeken gélszűrést végezhetünk, vagy ioncserélő gélszűrést végezhetünk dietil-amino-etil- (DEAE)-funkciós csoportoto tartalmazó gélekkel, például Sephadex® DE- 25 AE-gélekkel (Pharmacia Fine Chemicals AB, Svédország), vagy adszorpciós kromatográfiás eljárást alkalmazhatunk, alumínium-oxidon vagy szüikagélen, és ezeket a továbbtisztítás során egymással kombinálhatjuk is. A tisztítási eljárások közé sorolhatjuk még a 30 vékonyréteg-kromatográfiát, a közepes nyomású, és nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárást is, megfelelő adszorbenseket, például szilikagélt és módosított szilikagél-Cjg-at (amelyet például szilikagél és oktadecü-triklór-szilán reagáltatásával kapunk) és 35 egyéb megfelelő anyagokat használva. A tisztítás céljára megfelel ezenkívül a megfelelő oldórendszerekkel végzett ellenáramú kromatográfiás eljárás is. A kammunocin színtelen, amorf por, amely vízben, metanolban, etanolban, propilénglikolban és dimetü- 40 szulfoxidban oldódik A kammunocin acetonban, metüén-kloridban, etü-acetátban, kloroformban, hexánban és 40-60 °C-os forráspontú petroléterben nehezen, vagy nem oldható. Ninhidrines festési vizsgálatban negatív reakciót mutat. 45 A kammunocin vékonyréteg-kromatográfiás értékei az alábbi rendszerekben a következők; Lemez: Kieselgel kész lemez, cikkszáma 5554 (Merck, Darmstadt) Kammunocin Rf értéke: etil-acetát-metanol-víz (4: 4:1) elegyben 0,47 butanolecetsav-víz (4:4:1) elegyben 0,39. Az 1. ábrán látható a kammunocin vékonyrétegkromatográfiás képe etil-acetát-metanol-víz (4:4: 1) elegyben, a detektálás 254 nm-en történt. A 2. ábrán látható a kammunocin analitikai nagynyomású folyadékkromatogramja, amelyet az alábbi körülmények között vettünk fel: oszloptöltet: ODS-Hypersü® (10 p., 4x120 mm) (HPLC-anyag oktadecü-triklór-szüán csoportokkal, Shandon, USA) 0,5 ml/perc 234 nm-nél metanol és 1%-os vizes ecetsavoldat 55:45 térfogatarányú elegye. A kammunocin olvadáspontja 270 °C, bomlás közben. átfolyási sebesség: kimutatás: oldószer: A kammunocin spektroszkópiás adatai az alábbiak: 1. UV maximum metanolban kb. 224,280,345 nm (3. ábra). A kammunocin UV-adszorpciós maximum értékeit 0,2 g/1 koncentrációértéknél határoztuk meg. Az adszorpciós spektrumot Uvikon 810 spektrofotométerrel határoztuk meg, a 200-800 nm tartományban. 2. Az IR-spektrumot (KBr-tabletta) Perion Elmer spektrométerrel P.E.521 mértük (4. ábra). A fenti spektroszkópiás adatok, valamint a 6. példában ismertetett kémiai és spektroszkópiás analíziseredmények arra utalnak, hogy a kammunocin egymással rokon peptid-antibiotikumok komplexe. A kammunocin egyedi jellemzője, hogy antibiotikus hatását Gram-pozitív baktériumok ellen csak kalciumionok jelenlétében fejti ki Más fémionok, például nátrium-, kálium-, bárium-, rubidium- és magnéziumionok nem rendelkeznek üyen hatással. Ezért a kammunocint olyan agaros tápközegben vizsgáljuk, amely legalább kb. lOmmól/lkalcium-kloridot tartalmaz. A fent megadott, kalciumban gazdag agarban a kammunocin in vitro mind érzékeny, mind rezisztens Staphylococcus aureus és Streptomyces faecalis törzsek ellen hatást mutat, üyen törzsek például a Bacüus subtilis, Sarcina lutea, Streptococcus pzogenes és Micrococcus luteus. A minimális gátló koncentráció (MHK) értékeket is meghatároztuk a kammunocinra. Az eredményeket az 1. táblázatban ismertetjük. 1. táblázat: Kammunocin minimális gátló koncentrációja Müller-Hington-agarban (Oxoid kézikönyv), különböző Ca2+-koncentrációk mellett. Mikroorganizmus Kalciumion-koncentráció (mmól/1) 0,0 2,5 10,0 30,0 60,0 S. aureus 209 P >100,0 25,0 6,3 1,6 <0,1 S. aureus 20464 Mak^ >100,0 100,0 25,0 1,6 1,6 4
