203256. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a kammunocin nevű új antibiotikum, és hatóanyagként e vegyületet tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 203 256 B 2 7. Szacharóz-nitrát-agar tenyészet: bőséges, sima, száraz légmicélium: jó, poros, gyengén kékesszürke hátoldal: enyhén sárga oldható pigment: gyengén ibolyaszínű 8. Pepton-marhahúskivonat-agar (tápagar) tenyészet: mérsékelt, kiemelkedő, száraz légmicélium: gyenge, poros, sötétszürke, hátoldal: szürkésrózsaszín oldható pigment: nincs. Az oldható pigment pH-indikátor tulajdonságú, savas közegben rózsaszínű, lúgos tartományban kékesibolyaszínű. A találmány szerinti eljárásban használt mikroorganizmus optimális tenyésztési hőmérséklet-tartománya kb. 25 és 35 °C között van. A mikroorganizmus a zselatint elfolyósítja a glükóz-pepton-zselatin tápközegben; a szervetlen só-keményítő-agar tápközegben a keményítőt hidrolizálja és a lefölözött tejet koagulálja. A Str. Y-84,36210 jól szaporodik Czapek-féle agaroldatban (Oxoid Handbuch) is. Csak tirozin-agarban figyelhető meg kis mértékben oldhatatlan, sötét pigment képződése, míg peptonélesztőkivonat-vas-agarban vagy tripton-élesztőkivonat-húslevesben nincs oldhatatlan pigmentképződés. A fenti mikroorganizmus szénforrás-asszimiláló képessége az alábbi: pozitív: D-glükóz, L-arabinóz, D-xilóz, I-inozit, D- mannit, D-fruktóz, ramnóz, galaktóz, maltóz, cellobióz, N-glutamát, mannóz, laktóz; kérdéses: szacharóz, szalicin; negatív: raffinóz, cellulóz, dulcit. A Str. Y-84,36210 törzset a streptomicin 1,6 pg/ml-nél nagyobb koncentrációban gátolja; kb. 7- 10% nátrium-klorid-koncentrációt visel el; és pH-tűrő képessége kb. pH 5,5-9,0. Az ismert mikroorganizmusok közölt tenyésztési és fiziológiai tulajdonságai a találmány szerinti eljárással izolált mikroorganizmushoz viszonyítva jelentős eltéréseket mutatnak. Ezenkívül a Str. Y-84,36210 törzs fermentálással új antibiotikum-komplexet, kammunocint termel. A fentiek következtében a találmány szerinti eljárással izolált mikroorganizmus új Streptomycestörzsnek tekintendő. Szakemberek számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti eljárásban nemcsak a fent definiált mikroorganizmus használható, hanem annak minden olyan természetes és mesterséges mutánsa és variánsa is, amely képes az új antibiotikum-komplexet, a kammunocint termelni. A találmány értelmében a kammunocint úgy állítjuk elő, hogy a Str. Y-84,36210 törzset előnyösen 6,0 és 9,0 közötti pH-tartományban, előnyösen 18 és 37 °C közötti hőmérsékleten, aerob körülmények között, szén- és nitrogénforrást, szervetlen tápsókat, és adott esetben nyomelemeket tartalmazó tápközegben tenyésztjük, majd az antibiotikumot a tenyészléből ismert módon izoláljuk Az új antibiotikum előállítására használt tápközeg szénforrásként előnyösen például glükózt, keményítőt, dextrint, glicerint, szacharózt, melaszt vagy olajat tartalmaz. A nitrogénforrás például szójababliszt, élesztőkivonat, marhahúskivonat, malátakivonat, kukoricalekvár, pepton és kazein lehet. Az új antibiotikum előállítására használt tápközeg szervetlen tápsóként/ásványi sóként például előnyösen nátrium-kloridot, magnézium-szulfátot, ammónium-szulfátot, vagy kalcium-karbonátot tartalmaz. Nyomelemként például vasat, mangánt, rezet, cinket vagy kobaltot alkalmazunk előnyösen. A találmány szerinti eljárás egy előnyös megvalósítási módja szerint a Str. Y-84,36210 törzset 26-28 °C-on, pH 6,4-6,6 értéken tenyésztjük A kívánt vegyületek legmagasabb hozamát 40-45 órán keresztül tartó fermentációval érjük el. A fermentálást előnyösen merített tenyészetben végezzük A fermentáció lefolyását és az új antibiotikum-komplex képződését a tenyészlé és a micélium antibakteriális hatásának mérésével követhetjük, tesztorganizmusként Staphylococcus aureus 290 P törzset használva, 30 mmól/1 kalcium-kloridot tartalmazó agar-tápközegben. Kívánt esetben a fermentálás során a tápközeghez habzásgátló szert - például Desmophen® (poliol, Bayer AG, Leverkusen, NSZK terméke) - is adhatunk A kammunocint a tenyészléből például megfelelő adszorbensen való közvetlen adszorpcióval vagy oldószeres extrahálással, majd azt követő adszorpcióval nyerhetjük ki. Oldószerként előnyösen például etilacetát vagy kloroform n-propanollal alkotott elegyeit, különösen előnyösen etil-acetát és n-propanol 2:1 térfogatarányú elegyét használjuk A tenyészet szűrletét vagy a szűrlet találmány szerinti vegyületet tartalmazó oldószeres ex tr akti imát például aktív szálai, polimer adszorbensen, így például Diaion® HP-20-on (Mitsubishi Chemical Indrustries, Japán) vagy Amberlit® XAD-on (polisztirol, akrilészter vagy aminoxid mátrixból álló polimer adszorbens, átlagos pórusátmérője 40 x 10-10-225 x 10“10 m, Rohm and Haas Co., USA) adszorbeálhatjuk Az oldószeres extraktumot az oldószer eltávolítása céljából előnyösen bepároljuk majd az adszorbensen kromatografáljuk A találmány szerinti vegyületet megfelelő mozgó fázissal, például kloroformmal, metalonnal vagy acetonnal, illetve ezek egymással alkott elegyével, vagy vízzel eluálhatjuk az adszorbensről, majd az eluátumot szárazra pároljuk Eluensként előnyösen metanolt használunk A kammunocint ioncserélő kromatográfiás eljárással is izolálhatjuk a tenyészet szűrletébőL Gyantaként például enyhén bázikus, polisztirol-, poliamin- vagy térhálósított aminoalkohol-poliakril-észter típusú anioncserélő gyantákat - például Dovex® (Dow Chemical Company, USA) vagy Amberlite® IRA 68 (Rohm and Haas Co., USA) gyantát használhatunk Az előnyösen alklamazható ioncserélő gyanta az Amberlite® IRA 86 (akril típusú, terc-amin funkciós csoporttal). Ebben az eljárásban a tenyészet szűrletét előnyösen oszlopkromatográfiás eljárásnak vetjük alá, amikor is Amberlite® IRA 68 (Cl-) anioncserélő gyantával töltjük az oszlopot. A találmány szerinti vegyületeket elő-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
