203255. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid interferonok előállítására
1 HU 203 255 B 2 rát), ezen találmány hibrid interferonjait négy betűvel jelölhetjük, ahol a betűk a jelen lévő szakaszt jelentik. Például: az (I) hibrid interferon a LyDFN-a-2 interferon ti. a LyIFN-a-2 rokonságban van az IFN-a B-vel, lásd fent) 1-3. szakaszából és a LyIFN-a-3 interferon („D”, ti a LyIFN-a-3 rokonságban van az IFN-ot D-vel, lásd fent) 4. szakaszából tevődik össze, s így IFN ,31 B2B3D4”-nek nevezzük. Annak érdekében, hogy a kívánt interferon előállítását megkönnyítsük, a LyIFN-ct-2-t, illetve a LyIFN-oc-3-at kódoló régiókat tartalmazó DNS-inszertumokat úgy kell módosítanunk, hogy a ligázos összekapcsoláshoz csak egyetlen Hindin (vagy Eco- RI), PvuH és PstI restrikciós hely legyen bennük. A 3. ábrából kitűnik, hogy a LyEFN-a-2 gén 3’extracisztron régiójában még egy PvuH hely van. Ezt a helyet azonban könnyen eltávolíthatjuk, például úgy, hogy egy hibrid vektort, amely a LyIFN-a-2 kódoló régióit tartalmazza, részlegesen hasítunk Puvn-vel, a keletkezett linearizált DNS-t összekapcsoljuk egy olyan DNS-szekvenciát tartalmazó linkerrel, amelyet a PstI restrikciós endonukleáz felismer, majd hasítunk Pstlgyel, az emésztett darabokat alacsony DNS-koncentráció mellett, ligáz segítségével összekapcsojuk, majd azokra a plazmidokra szelektálunk (például restrikciós analízissel), amelyek a kívánt módosulást tartalmazzák, azaz a megrövidített, PvuII helyet nem tartalmazó 3’extracisztron régiót. Ezzel analóg módon előnyösen módosíthatjuk az IFN gének klónozására használt vektorokat úgy, hogy csak egyetlen Hindin, PvuII és PstI restrikciós hely legyen bennük. A találmány szerinti eljárásban felhasznált hibrid vektorok DNS-szekvenciája az (I)-(VI) szekvenciájú hibrid interferonok valamelyikét kódolja, s az a szekvencia mesterségesen hozzá van kapcsolva egy kifejeződést szabályozó szekvenciához. A találmány tárgyát képezik az ezen hibrid vektorok előállítására irányuló eljárások is. A vektor kiválasztása a transzformáláshoz szánt gazdasejttől függ. Alkalmas gazdák például azok a mikroorganizmusok, amelyekben nincsenek restrikciós enzimek, vagy modifikáló enzimek, vagy ezekből kevés van bennük, üyenek az élesztők, például a Saccharomyces cerevisiae és egyes baktériumtörzsek, különösen az E. coli törzsek, például az E. coli X1776, E. coli HB101, E. coli W3110, E. coli HB101/LM1035, E. coli Ja221 vagy E. coli K12294 törzs, továbbá a Bacülus subtilis, Bacillus stearothermophylus, Pseuodomonas, Haemophüus, Streptococcus és mások, ezenkívül a magasabb fejlődési fokon levő szervezetek sejtjei, különösen az elismert emberi vagy állati sejtvonalak.. Az E. coli fent említett törzsei, például az E. coli HB 101 és az E. coli JA221 „ továbbá a Saccharomyces cerevisiae kitüntetett gazda mikroorganizmusok. Elvben minden olyan vektor alkalmas lehet, amelyik replikálódik és kifejezi a hibrid interferon géneket a választott gazdasejtben. Példaként felsorolunk olyan vektorokat, amelyek alkalmasak arra, hogy E. coli törzsben kifejezzék a hibrid interferon géneket: bakteriofágok, például a X. bakteriofág származékai, vagy plazmidok. ilyen különösen a Col El plazmid és származékai, például a pMB9, pSF2124, pBR317 vagy pBR322. A jelen találmány előnybe helyezett vektorai a pBR322-ből származnak. A megfelelő vektorok komplett replikont és olyan marker gént tartalmaznak, mely lehetővé teszi az expressziós plazmiddal transzformált gazdasejt szelektálását és azonosítását egy fenotípusos jellemvonás alapján. A megfelelő marker gén olyan tulajdonsággal ruházza fel a gazdasejtet, hogy például rezisztenssé válik nehéz fémekkel, antibiotikumokkal és egyéb üyen anyagokkal szemben. Ezenkívül, a találmány szerint használható előnyös vektorok, a replikon és a marker gén régiókon kívül restrikciós endonukleázokat felismerő szekvenciákat is tartalmaznak, hogy be lehessen építeni ezekre a helyekre a hibrid IFN gént, és ha van megfelelő, az expressziót szabályozó szekvenciát. Előnyös vektor a pBR322 plazmid, mely inakt replikont és tetraciklinnel és ampicillinnel szembeni rezisztenciáért felelős két gént (tetR és ampR) tartalmaz, továbbá számos restrikciós endonukleáz számára egyetlen felismerő helyet, üyen példáid a PstI (az amp® génben hasít, a tetR gén változatlan marad)pBR(AP)/LyIFN-alfa-2 BamHI, Hindin és Sáli )mindhárom a tetR génben hasít, az amp5* gén érintetlen marad), továbbá a Nrul és EcoRL Számos expressziószabályozó szekvencia használható a gén kifejeződésének irányítására. A transzformálandó gazdasejtnek különösen azokat az expresszióit szabályozó szekvenciáit használjuk, amelyek magas kifejeződési szintű génekhez tartoznak. Abban az esetben, amikor a pBR322 hibrid vektorként és az E. coli gazda mikroorganizmusként szerepel, az alábbi operonok és gén-kifejeződést szabályozó szekvenciák (melyek többek között promotert és riboszóma kötő helyet tartalmaznak) a megfelelőek: laktóz operon, triptofán operon, arabinóz operon és hasonlók, a ß-laktamäz gén, a X-fágN génjének megfelelő szekvenciákvagyazfdfág burok protein génje és így tovább. Míg a pBR322 plazmid eleve tartalmazza a ß-laktamäz gén (ß-lac gén) promoterét, addig a többi expressziószabályozó szekvenciát be kell a plazmidba építeni. Azok a vektorok, amelyek az élesztőben replikálódás és kifejezés szempontjából megfelelnek, azok élesztő replikációs kezdőpontot és az élesztőre nézve szelektív genetikus markért tartalmaznak. Megfelelnek olyan hibrid vektorok is, amelyekben élesztő replikációs kezdőpont van, például kromoszomális autonóm módon replikálódó szegmentum (ARS = autonomously replicating sequence), s ez a transzformálás után az élesztő sejten belül a kromoszómán kívül marad és az autonóm módon replikálódik. Ezenkívül azok a hibrid vektorok is használhatók, amelyek az élesztő 2 p. plazmid ja DNS-ével homológ szekvenciákat tarvén integrálódnak a sejten belül már jelen lévő 2 p. plazmidba vagy autonóm módon replikálódnak a sejtben. Magas transzformációs frekvenciájú és sok másolatszámmal működő plazmidok számára különösen alkalmasak a 2 p, szekvenciák. A jelen találmány előnybe helyezett élesztő vektora a pJDB207 plazmid 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
