203255. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid interferonok előállítására
1 HU 203 255 B 2 Az élesztők számára megfelelő marker gének különösen azok, amelyek a gazdasejtnek antibiotikum rezisztenciát kölcsönöznek vagy az auxotróf élesztő mutánsok esetében azok a gének, amelyek a gazdasejt lézióját teszik teljessé. A megfelelő gének például azok, amelyek a cikloheximid antibiotikummal szembeni rezisztenciát adják át vagy pedig prototróf tulajdonsággal látják el az auxotróf élesztő mutánst, üyen például az URA3, LEU2, HIS3 vagy különösen a TRP1 gén. A még előnyösebb élesztő hibrid vektorok bakteriális gazdasejtben, különösen az E. coliban is tartalmaznak replikációs kezdőpontot és marker gént, így a hibrid vektorok és intermedier származékaik szerkesztése és klónozása bakteriális gazdasejtben is megvalósítható. Élesztőben való kifejeződés szempontjából például azok az alkalmas expressziószabályozó szekvenciák, amelyek magas szinten fejezik ki az élesztő géneket. Ilyen módon használható tehát a TRP1 gén AD Hl vagy ADHII gén, savanyú foszfatáz gén (PH03 vagy PH05) és izocitokróm gén promoterei, vagy a glükolitikus folyamatban részt vevő promoterek, üyenek az enoláz, gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (GAPDH), 3-foszfoglicerátkináz (CPK), hexokináz, privát-dekarboxiláz, foszfo-frukto-kináz, glükóz-6- foszfát-izomeráz, 3-foszfo-glicerát-mutáz, piruvátkináz, trióz-foszfát-izomeráz, foszfo-glükóz-izomeráz és glükókináz gének promoterei. A jelen találmány által előnybe helyezett vektorok transzkripció szabályozással ellátott promotereket tartalmaznak, üyenek például a PH05, ADHII és GAPDH gének promoterei, amelyeket be vagy ki lehet kapcsolni a tenyésztési körülmények változtatásával. A PH05 promotert például be lehet kapcsolni vagy ki lehet kapcsolni azáltal, ha növeljük vagy csökkentjük a táptalaj anorganikus foszfát koncentrációját. A promotert mesterségesen kapcsoljuk a kódoló régióhoz úgy, hogy az a hibrid interferon kifejeződésének hatékonyságát biztosítsa. A jelen találmány egyik megvalósítási változatában közvetlenül kapcsolódik az érett IFN kódoló szakaszához úgy, hogy a találkozás helyén transzlációs start szignál (ATG) van beépítve. A promotemek a hibrid IFN-t kódoló szakaszhoz kapcsolódásának előnyös régiója a fő mRNS startja és az illető promoterhez természetesen kötött gén ATG-je közt helyezkedik el. A jelen találmány egy másik kiviteli változatában, különösen, ha gazda-mikroorganizmusként élesztőt alkalmazunk, a szerkezet egy szignál szekvenciát is tartalmaz. Azok az alkalmas szignál szekvenciák, amelyek a használt promoterhez természetesen kapcsolódnak Felhasználhatjuk például a PH05 szignál szekvenciát, továbbá az élesztő invertáz vagy a-faktor gének szignál szekvenciáját. Azokat a kombinációkat helyezzük előnybe, amelyek a szignál szekvencia és az érett hibrid IFN aminosav szekvenciája közti pontos hasítást teszik lehetővé. Olyan járulékos szekvenciákat, mint a pro- vagy spacer-szekvenciák, amelyek specifikus processzor szignálokat hordozhatnak, vagy nem hordozhatnak, szintén beépíthetünk a szerkezetbe olyan célból, hogy megkönnyítsük a prekurzor molekulák helyes kezelését. Emellett fuzionált proteineket is termelhetünk belső processzor szignálokkal, amelyek elősegítik a megfelelő érést in vivo vagy in vitro. A találmány szerinti eljárásban használható vektorok - előnyösen - egy 3 ’-n-nél elhelyezkedő olyan génszekvenciát is magukba foglalnak, amely megfelelő szignálokat tartalmaz a transzkripció befejezéséhez és a poliadenilációhoz. Az üyen 3’-nél lévő szekvenciák például azok a gén szekvenciák, amelyek természetesen kapcsolódnak az alkalmazott promoterhez. Abban az esetben, ha gazda-mikroorganizmusként élesztőt használunk, az alkalmazott expressziót szabályozó szekvencia, a PH05 promoter, akkor előnyös, ha a 3’-t határoló szekvencia a PH05 géné. A találmány szerinti eljárás egy előnyös megvalósítási módja esetén a hibrid vektorok egy gazda törzsben replikációra és fenotípusos szelektálódásra képesek. Ezek magukba foglalnak egy promotert és egy, az új hibrid interferonok valamelyikét kódoló DNS-szekvenciát, s e szóban forgó DNS-szekvencia a transzkripció start és terminátor szignáljával, valamint a transzláció start és stop szignáljával együtt az ülető hibrid vektorban található az említett promoter szabályozása alatt oly módon, hogy egy transzformált gazdasejtben kifejeződvén, a találmány szerinti hibrid interferont állítja elő. A találmány szerinti eljárásban használt hibrid vektorokat előáüíthatjuk úgy, hogy a LyIFN-a-2 és LyIFN-a-3 kódoló szakaszainak megfelelő szegmentumokat in vitro ligázzal összekapcsoljuk és a keletkezett hibrid IFN gént megfelelő vektorba juttatjuk be, vagy pedig úgy, hogy egy egyedi IFN DNS-szegmentumot ligázzal összekapcsolunk egy olyan linearizált vektor DNS-sel, amely már tartalmazza a még hiányzó szakaszokat, hogy üyen módon a kívánt hibrid interferont kódoló gén áüjon elő. Előnyös, ha az amino terminális vég-szekvenciát adó DNS-szegmentum már fuzionálódott az expressziószabályozó szekvenciával. A LyIFN-a-2 és LyIFN-a-3 kódoló régióinak megfelelő szegmentumokat főként a jelen találmány által előnybe helyezett kiindulási vektorból vesszük, azaz a pBR322-ből származó pAM2 és pAM21 plazmidból. A pAM2 plazmid egy HindlH-Pstl inszertumot tartalmaz, amely magába foglalja a LyIFN-ct-3 kódoló régióját ß-laktanuz promoter szabályozása alatt. A pAM2 plazmid vektor része Pvuü-vel szemben rezisztens. A pAM21 plazmid egy HindlG-Pstl inszertumot tartalmaz, amely magában foglalja a LyIFN-a-2 kódoló régióját - ennek 92-es pozíciójában van az egyetlen PvuII hely - a ß-laktamäz promoter szabályozása alatt. A pAM21 plazmid vektor része ugyancsak rezisztens a Puvü-vel szemben. A ,3iB2B3D4” hibrid interferont főként úgy állítjuk elő, hogy a pAM21 plazmid nagy Pstl-PvuII fragmentumát, a pAM21 plazmid kis Sau3A-Pvuü fragmentumát és a pAM2 plazmid kis Sau3A-PvuII fragmentumát és a pAM2 plazmid kis Sau3A-PstI fragmentumát ligáz segítségével összekapcsoljuk. Ezzel a 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6
