203255. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid interferonok előállítására
1 HU 203 255 B 2- a (IV) szerkezetű ,3, D2D3D4” hibrid interferon, CYS ASP LEU PRO GLN THR HIS SER LEU GLY ASN ARG ARG ALA LEU ILE LEU LEU ALA GLN MET ARG ARG ILE SER PRO PHE SER CYS LEU LYS ASP ARG HIS ASP PHE GLU PHE PRO GLN GLU GLU PHE ASP ASP LYS GLN PHE GLN LYS ALA GLN ALA ILE SER VAL LEU HIS GLU MET ILE GLN GLN ILE PHE ASN LEU PHE THR THR LYS ASP SER SER ALA ALA TRP ASP GLU ASP LEU LEU ASP LYS PHE CYS THR GLU LEU TYR GLN GLN LEU ASN ASP LEU GLU ALA CYS VAL MET GLN GLU GLU ARG VAL GLY GLU THR PRO LEU MET ASN ALA ASP SER ILE LEU ALA VAL LYS LYS TYR PHE ARG ARG ILE THR LEU TYR LEU THR GLU LYS LYS TYR SER PRO CYS ALA TRP GLU VAL VAL ARG ALA GLU ILE MET ARG SER LEU SER LEU SER THR ASN LEU GLN GLU ARG LEU ARG ARG LYS GLU - az (V) szerkezetű ,3iD2B3B4” hibrid interferon és CYS ASP LEU PRO GLN THR HIS SER LEU GLY ASN ARG ARG ALA LEU ILE LEU LEU ALA GLN MET ARG ARG ILE SER PRO PHE SER CYS LEU LYS ASP ARG HIS ASP PHE GLU PHE PRO GLN GLU GLU PHE ASP ASP LYS GLN PHE GLN LYS ALA GLN ALA ILE SER VAL LEU HIS GLU MET ILE GLN GLN ILE PHE ASN LEU PHE THR THR LYS ASP SER SER ALA ALA TRP ASP GLU ASP LEU LEU ASP LYS PHE CYS THR GLU LEU TYR GLN GLN LEU ASN ASP LEU GLU SER CYS VAL MET GLN GLU VAL GLY VAL ILE GLU SER PRO LEU MET TYR GLU ASP SER ILE LEU ALA VAL ARG LYS TYR PHE GLN ARG ILE THR LEU TYR LEU THR GLU LYS LYS TYR SER SER CYS ALA TRP GLU VAL VAL ARG ALA GLU ILE MET ARG SER PHE SER LEU SER ILE ASN LEU GLN LYS ARG LEU LYS SER LYS GLU - a (VI) szerkezetű ,31B2D3B4” hibrid interferon. A legelőnyösebb találmány szerinti eljárással előállított hibrid interferon a ,3iD2D3D4” (V) és a ,3jB2D3B4” (H). Egy találmány szerinti hibrid interferon a találmány szerinti eljárással rekombináns DNS-technikával állítható elő, mely például a következő lépésekből áll: a) a szóban forgó hibrid interferont kódoló strukturális gént tartalmazó DNS előállítása a LyIFN-a-2 és LyIFN-a-3 interferon 60,92, illetve 150. aminosavának megfelelő helyeken in vitro rekombinációval, vagy a DNS kémiai úton való szintézise és ezután a kapott DNS beépítése egy megfelelő kifejező vektorba; b) a hibrid IFN strukturális génjét hordozó vektor bevitele egy recipiens gazdasejtbe; c) a transzformált gazdasejtek elválasztása a nem transzformálódott sejtektől, rendszerint olyan tenyésztési körülmények révén, melyekben csak a transzformált sejtek a túlélők; d) a transzformált gazdasejtek tenyésztése olyan körülmények mellett, amelyek elősegítik a hibrid IFN strukturális génjének a kifejeződését és e) a kifejeződött hibrid EFN izolálása. Az alkalmazott módszereket a következő részletes leírás és a csatolt ábrák fogják leginkább megvilágítani. Az alábbiakban ismertetjük az ábrákat: Az 1. ábra az érett LyIFN-a-3 és LyIFN-a-3 aminosav szekvenciáját hasonlítja össze. A LyIFN-a-3- ból csak azoket az aminosavakat írtuk le, amelyek a LyIFN-ct-2 megfelelő aminosavától különböznek, egyébként aminosavai azonosak a LyIFN-a-2 aminosavaival. A 2. ábra a LyIFN-alfa-2 és LyIFN-alfa3 kódoló régiójának nukleotid szekvenciáját és 3’extracisztron régiójának részeit mutatja be. Az ATG transzlációt iniciálé kodonokat, a terminátor tripleteket és az alkalmas restrikciós helyeket aláhúztuk. A kódoló tripleteker megszámoztuk. A 3. ábra a pHR(AP)/LyIFN-a-2 és a pHR(AP)/LyIFN-a-3 plazmid kis szegmentumainak Hidlü-Pstl restrikciós térképét ábrázolja. A fehér sáv (LyIFN-alfa-3), illetve a fekete sáv (LyIFN-alfa-2) határolja az érett IFN-ek kódoló régióit. Alul az IFN polipeptid (166 aminosav) primer struktúrájának négy részre való tagozódását mutatjuk be. Zárójelben annak az aminosavnak a sorszámát adjuk meg, amelynek tekintetében az alfa-2 és az alfa-3 IFN-ek egymástól különböznek. A 4. és 5. ábrán a hordozóhoz kötött redioaktivitást ábrázoljuk az IFN-alfa-2 mennyiségének függvényében, melyet a vizsgálandó oldatban szendvics RIA-val mértünk. 1 .Hibrid IFN strukturális gént tartalmazó hibrid vektorok előállítása A humán interferon-alfa két szubtípusának, azalfa- 2-nek és az alfa-3-nak a cDNS-ét E.coliba klónozzuk be. A pBR(AP)/LyIFN-alfa-2 és pBR(AP)/LyIFN-alfa- 3 plazmidban olyan HindlI-PstI (vagy EcoRI-PstI) DNS-inszertum van, amely pBR(AP)/LyIFN-alfa-2-2, illetve LyIFN-alfa-3 kódoló régióját tartalmazza ßlaktamáz promoter'SZabályozása mellett (lásd a 76489 számú európai szabadalmi bejelentést). Az illető inszertumok restrikciós térképei a 3. ábrán láthatók. Könnyen megállapítható, hogy a génekben közös restrikciós helyek vannak (az IFN aminosav szekvenciájának 60,92 és 150-edik pozíciójában helyezkednek el); amelyeket előnyösen használhatunk fel kedvező biológiai és/vagy fizikai tulajdonságokkal rendelkező hibrid interferonokat kódoló új gének szerkesztésénél. Tehát a LyIFN-a-2 és LyIFN-a-3 gének közt úgy keletkezhetnek rekombinánsok (egyszeres vagy többszörös kicserélődések), ha in vitro rekombinálódnak a PvuH helyen (92-es pozíció) és/vagy a Sau3A helyeken (60-as és 150-es pozíció). Minthogy ezek szerint az interferonok primer szerkezete négy szakaszra osztható (első szakasz: 1-60 aminosav, második szakasz: 61 -92 aminosav, harmadik szakasz: 93-150 aminosav és negyedik szakasz: 151-166 aminosav; lásd a 3. áb6 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
