203255. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid interferonok előállítására
1 HU 203 255 B 2 b) A 144 BS monoklonális antitest kötése makrogyöngyökhöz: Polisztirol gyöngyöket (6,3 mm átm., Spherotech AG, Zürich) inkubálunk 4 °C-on 16 órán át óvatos himbálással egy olyan PBS kötő-pufferben (pH-8), 5 mely5mMEDTA-t,0,l%NaN3-otés 1 mg/ml 144 BS MAb-et tartalmaz. Az oldat 10 ml-ére 20 gyöngy jusson. A fedett gyöngyöket ezután blokkoló puff erbe - 10% lászérumot és 0,1% NaN3-ot tartalmazó PBS - visszük át és ebben tartjuk felhasználásig, legalább 24 10 óráig, 4 °C-on. A többi MAb kötést ugyanígy végezzük, c) Vizsgálati eljárás: Műanyag csöveket (Falcon, 5 ml) fedünk 0,5 ml 10% 15 lószérumot és 0,1% NaN3-ot tartalmazó PBS blokkoló pufferrel egy éjszakán át. A puffert leszívással távolítjuk el, majd közvetlenül a cső aljába beviszünk 0,2 ml-t, blokkoló puff erben, az IFN-tartalmú vizsgálandó vagy standard oldatból A 24. b) példa szerint MAb-vel fedett és blokkolt gyöngyöt hamar megszárítjuk egy tiszta kendőn és óvatosan átvisszük - a habképződést elkerülve - az IFN-oldatot tartalmazó csőbe. Agyöngyöt 4- 6 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk óvatosan himbálással. Az IFN-oldatot leszívással távoli tjük el és minden gyöngyöt háromszor mosunk 2 ml blokkoló pufferrel. A gyöngyöt ezután 0,2 ml125I-dal jelzett második antitest - 8-103 cpm - oldatával (24a) példa) inkubáljuk 16 órán át 4 °C-on, majd háromszor mossuk PBS-sel és új csőbe visszük át a számláláshoz. A 6. táblázatban az EFNa-3 és EFNa-2 standard oldatainak a szilárd fázisú (gyöngyhöz kötött) első antitest és a 125I-dal jelzett második antitest különböző kombinációival kapott eredményeit mutatjuk be. 6. táblázat Megfelelő monoklonális antitest kombináció kiválasztása az IFNa-2 és IFNa-3 polipeptid vizsgálatához Szüárd fázisú antitest Izotóppal jelzett második antitest 103NEAnl-re IFNa-3 kapott beütések száma (cpm) IFNa-2 144 BS 2K2 113 105 144 BS 144 BS 103 58 144 BS YOK 16,793 313 144 BS NK2 78 3,733 2K2 144 BS 52 2 poliklonálisx 144 BS 1,572 546 x poliklonális: gyöngyhöz kötött poliklonális birka anti- IFN-a-antitest (Celltech) Az IFNa-3 kimutatására a legjobb eredményeket a 144 BS MAb-nek a YOK MAb-el való kombinációjával kaptuk, az IFNa-2 kimutatásához a 144 BS MAb és a NK2 kombinációja bizonyult a legjobbnak. A 4. ábra bemutatja a szilárd fázishoz kötött 144 BS 40 MAb és a radióizotóppal jelzett NK2 MAb kombináviójával végzett kvantitatív titrálási kísérlet eredményét. A vizsgálat lineáris összefüggést mutat az EFNot- B típusú polipeptidek koncentrációjával -1-5000 NE/ml, azaz 2 pg/ml - 10 ng/ml tartományban - függ- 45 vényében. Az IFNa-2 és a „Standard aB” típusú polipeptid (Celltech) titrálási görbéje közti különbségeket a két IFN-készítménynél végzett bioassay-nél kapott különbségnek tulajdonítjuk. Hasonló eredményeket kaptunk az IFNaD polipep- 50 tidek kvantitatív mérési kísérleteinél, a szüárd fázishoz kötött 144 BS MAb és a jelzett YOK MAb kombinációjával. A meghatározás megbízhatóan kimutat 1 NE/ml (2 pg/ml) EFNa típusú polipeptideket. A szilárd fázishoz kötött 144 BS MAb és a NK2 MAb kom- 55 binációját fel lehet használni IFNaF típusú polipeptidek meghatározására is. d) Rövidített vizsgálati eljárás (szimultán meghatározás): 60 A 24c) példában leírt általános módszert használva, a MAb-vel fedett gyöngyöt 3 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk a vizsgálandó oldattal (0,1 ml) és a radioaktív izotóppal jelzett második antitesttel (0,1 ml) együtt, kihagyva a közbülső mosásokat. Az 5. ábrán látható, hogy a rövidített szimultánmeghatározás megbízhatóan használható olyan IFNaB típusú polipeptid (ilyen az EFNa-2) minták gyors szűrésére, amelyek 150 NE/ml-t, vagy ennél többet tartalmaznak, de ez a módszer jelentősen kevésbé érzékeny, mint a 24c) példában leírt eljárás. e) Tesztkészlet a bead-radio-immun-tandem-assayhezt A 24c) példában leírt meghatározáshoz való tesztkészlet tartalma a következő: 100 db 5 ml-es Falcon műanyag cső, 100 db 6,3 mm átmérőjű, 144 BS monoklonális antitesttel fedett polisztirol gyögy 10% lószérum és 0,1% NaN3 tartalmú PBS-ben, 20 ml * 251-dal jelzett YOK monoklonális antitest, specifikus aktivitása 4 j 05 cpmyml) 2 ml 104NE7ml tartalmú standard IFNa-1 oldat, 2 ml 104NE/ml tartalmú standard IFNa-2 oldat, 2 ml 104NE/ml tartalmú standard IFNa-3 oldat. 24
