203255. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid interferonok előállítására
1 HU 203 255 B 2 1000 ml 10% lószérumot és 0,1% NaN3-ot tartalmazó PBS, kalibrációs görbe. 25. példa Enzim-immunassay (ELISA) a) A 144 BS monoklonális antitest jelzése alkalikus foszfatázzal: 1,4 PBS-ben oldott 1,4 mg 144 BS MAb-t 5 mg alkalikus foszfatázzal (Sigma P6774, VII-T típus) tartalmazó oldattal reagáltatunk 2 óra hosszat Voller és munkatársai [Bull. World Health Organ., 53, 55 (1976)] standard módszere szerint 0,2%-os (térf/térf.) glutáraldehid használatával. A konjugátumot 5 ml 1 mM MgC12-t, 1% BSA-t és a 0,02% NaN3-ot tartalmazó 0,05 M trisz pufferbe (pH=8,0) visszük át. Az oldatot sötét helyen, 4 °C-on tartjuk b) A meghatározás módja: Polipropüén mikrotitráló lemezeket (Dynatech Labs., Ind.) fedünk 150 pl (pH-8,0) puff erben (karbonáttal puff erőit, 0,02% NaN3 tartalmú 0,9%-os konyhasóoldat) oldott NK2 monoklonális antitesttel (Celltech, 10 pg/ml), 2 óra hosszat 37 °C-on és egy éjszakán át 4 °C-on tartva a lemezeket. A lemezeket ötször mossuk PBS-sel és a még jelen lévő protein-reaktiv helyeket úgy telítjük, hogy a lemezeket 1 órán át 37 °C-on 250 pj 0,2% zselatint és 0,2% NaN3-ot tartalmazó PBS puff erben (pH-7,4) inkubáljuk Az Uyen módon fedett lemezek 4 °C-on néhány napig eltarthatok ebben a puff erben. A vizsgálandó oldat vagy az IFNa szubtípusokat tartalmazó standard oldat hígításaiból 50 pJ-t, 50 pJ puffert (pH=7,4) és a 144 BS foszfatázzal jelzett antitest oldatából, melyet l:100-ra hígítottunk a (pH~7,4-es pufferrel, 50 pJ-t összekeverünk a mikrotitráló lemez tartályaiban és a lemezt 2 óra hosszat 37 °C-on és 30 percet 4 °C-on inkubáljuk. A lemezeket ötször mossuk PBS-sel, majd 30 percig 37 °C-on inkubáljuk 150 pjp-nitrofenü-foszfát-oldattal (10%os dietanolamin pufferben 1 mg/ml, MgCl2 0,5 mM; pH-9,8). Az optikai sűrűséget 405 nm-en mérjük, meghatásozzuk a felszabaduló p-nitrofenolt, amely arányos a vizsgálandó oldatban lévő DFN-a szubtípus mennyiségével. A módszert felhasználhatjuk IFNaB típusú (üyen az IFNa-2) vág IFNaF típusú polipeptidek mennyiségi meghatározására. Az IFNctD típusú (üyen az IFNa-3) poüpeptidek meghatásozásakor a mikrotitráló lemezt YOK monoklonális antitesttel (Ceütech) fedjük NK2 helyett. Hasonló eredményeket kapunk ha a mikrotitráló lemezeket 144 BS MAb-del fedjük és második antitestként foszfatázzal konjugált NK2, illetve YOK MAb-eket használunk c) ELISA-tesztkészlet A 25b) példában leírt módszerhez szolgáló tesztkészlet tartalma; polipropüén mikrotitráló lemezek, 20 pJ NK2 monoklonális antitest (10 pg/ml) karbonát pufferben (0,9% NaCl, 0,42% NaHC03, 0,0072% Na2C03,0,02% NaN3), 1 ml alkalikus foszfatázzal konjugált 144 BS MAb (10.1 példa, 0,3 mg antitest/ml) Tris pufferben (0,05 p. trisz 1 mMMgCl2,1% BSA, 0,02% NaN3; pH-8,0), 2 ml 104 NE/ml IFNa-1 tartalmú standard oldat, 2 ml 104 NE/ml IFNa-2 tartalmú standard oldat, 2 ml 104 NE/ml IFNa-3 tartalmú standard oldat, 300 ml PBS, 300 ml puffer; pH=7,4 (0,02% zselatin, 0,2% NaN3 PBS-ben), 50 ml p-nitrofenü-foszfát (1 mg/ml) dietanolamin pufferben (10%; 0,5 mM MgCl2, 0,02% NaN3, a pH=8,9-re beállítva HCl-lel), kalibrációs görbe, színerősségskála. 26. példa Hibrid interferonok tisztítása precipitációs és kromatográfiás módszerekkel A ,3iD2D3D4” interferont tartalmazó oldat 1 literét, amelyet centrifugálással derítettünk (13-15. példa), 2 M sósavval addig savanyítjuk, míg pH-ja a 2,2 értéket el nem éri. Az oldatot 1 órán át 4 °C-on keverjük és a kicsapódott proteint centrifugálással (Sorvaü GSA rotor, 12000 ford/perc, 4 °C, 20 perc) választjuk el. Az üledéket eldobjuk és a felülúszót szüárd ammónium-szulfáttal 30%-ra telítjük Az oldatot 1 órán át 4 °C-on keverjük, majd centrifugáljuk. Az interferont tatartalmazó felülúszót 0,1 M ammónium-hidrogénkarbonát oldattal (pH=8,2) szemben dializáljuk Az oldat interferonaktivitása mintegy 108 NE/ml volt. Egy oszlopot, mely 50 ml kelátképző Sepharose 6B- t (Pharmacia) tartalmaz és amelyre a gyártó cég előírása szerint Cu2+ ionokat vittünk fel, kiegyensólyozunk 250 ml 0,05 M nátrium-acetátot (pH=7,0) és 0,5 M NaCl-t tartalmazó oldattal. Ezután a dializált oldatból (lásd fent) 200 ml-t viszünk az oszlopra 4 °C- on. Az oszlopot 150 ml kiegyensúlyozó puff errel mossuk A megkötött interferont lineáris gradiens eluációval, 250 ml 0,05 M nátrium-acetát (pH=7,0) és 0,5 M NaCl 250 ml 0,05 M nátrium-acetát (pH=2,8) és 0,5 M NaCl oldatok használatával oldjuk le, majd mosás következik 150 ml 0,05 M nátrium-acetát (pH=2,8) és 0,5 M NaCl tartalmú oldattal. Az aktív interferon frakciókat egyesítjük és 0,05 M trisz 3C1 puff errel (pH=8,0) szemben dializáljuk. A dializált oldat interferonaktivitása megközelítőleg 108 NE/ml. Az oszlop maximális kapacitása ,3jD2D3D4” interferonra körülbelül 75 mg. 50 ml Q-Sepharose anioncserélőt (Pharmacia) tartalmazó oszlopot kiegyensúlyozunk 0,05 M triszJICl puff errel (pH=8,0). A fenti, dializált interferon oldatból 100 ml-t ráviszünk az oszlopra szobahőmérsékleten. Az oszlopot ezután 50 ml kiegyensúlyozó oldattal mossuk A megkötött interferont lineáris gradiens alkalmazásával, 0-0,7 M NaCl (0,05 mólos triszJIClben, pH=8,0) eluáljuk A tiszta interferon körülbelül 0,3 M NaCl-nál eluálódik. Az aktív frakciók SDS-PAGE-el végzett vizsgálatban egyetlen sávot adnak és 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 25
