203246. lajstromszámú szabadalom • Eljárás daganatgátló platina (IV)-diamin-komplex és hatóanyagként e vegyületet tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 203 246 B 2 A biológiai hatás vizsgálata Citotoxicitás megállapítása in vitro vizsgálatban A platinakomplex citotoxikus hatását in vitro kísérletben B16-F10 egérmelanóma-, HCT -116 emberi bélkarcinóma-, A 2780 emberi petefészek-karcinóma- és két A2780, ciszplatinnal szemben rezisztens altörzs sejtjein vizsgáltuk. A B16-F10 sejttörzset Eagle-féle minimál-esszenciális táptalajon Eagle-sókkal (Gibco) tenyésztettük, és a közeghez 2 mmól L-glutamint, 2,06 mmól nátrium-piruvátot, 0,26 egység/ml inzulint, 10 egység/ml penicillint és 10 pg/ml sztreptomicint, továbbá nem-esszenciális aminosavakat (0,6 tömeg% mennyiségben) és 10 tömeg% szarvasmarhamagzatszérumot adtunk A HCT-116 sejteket McCoy-5A közegben tenyésztettük (Gibco-féle módosított közegben), amelyet 2 mmól L-glutaminnal, 0,12 mmól L- szerinnel, 0,17 mmól aszparaginnal, 1,5 mmól nátrium-piruváttal, 0,625 tömeg% esszenciális aminosavakkal, 0,67 tömeg% nem-esszenciális aminosavakkal, 0,6% vitaminnal, 10 tömeg% borjúmagzatszérummal, 10 egység/ml penicillinnel és 10 pg/ml sztreptomicinnel egészítettük ki. Az A2780 sejttörzset RPMI-1640 közegben tenyésztettük (beszerzési helye: Gibco Laboratories), amelyet 10 tömeg% borjúmagzatszérummal, 2 mmól L-glutaminnal, valamint penicillinnel és sztreptomicinnel egészítettünk ki. Valamennyi sejttörzset 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk inkubátorban 5 térf.% szén-dioxidot tartalmazó, nagy nedvességtartalmú levegőben. A logaritmikus szaporodási fázisban lévő sejteket enyhe tripszinezéssel begyűjtöttük, és 96 üreget tartalmazó mikrotitráló lemez üregébe 4000 sejtet helyeztünk. A lemezeket éjszakán át 37 °C hőmérsékleten 5% szén-dioxidot tartalmazó levegőben inkubáltuk, hogy a sejtek a lemezhez tapadjanak. Ezután a sejteket a platinakomplexxel, vagy ciszplatinnal 72 órán át inkubáltuk Ekkor a lemezeket megfordítottuk és rázogattuk a közeg, farmakológiaüag hatásos vegyületek és a fellazult sejtek eltávolítása céljából. Foszfáttal pufferolt, fiziológiás konyhasóoldattad készült 10%-os formaldehid-oldatot adtunk hozzá, és a sejteket 10 percig fixáltuk Ezután a fixatív anyagot eltávolítottuk, a lemezeket levegőn szárítottuk 15 percig 0,0075 tömeg%-os kristályibolya-oldattal festettük, kétszer mostuk, majd levegőn szárítottuk A foltot 0,2 ml 1:1 arányú 0,1 M ecetsav-etanol eleggyel oldottuk, és az optikai sűrűséget Dynatech MR 600 mikrotitráló-lemez-leolvasóval meghatároztuk Az IC50-értékeket (azt a jig/ml-ben megadott koncentrációt, amely a sejtek szaporodását 50%-ban gátolta) az abszorpciós adatok lineáris regressziós analízisével számítottuk ki. Az alábbi ,A” táblázatban foglaltuk össze in vitro citotoxicitási vizsgálataink eredményeit. A találmány szerinti (3) képletű vegyület mind az öt sejttípussal szemben citotoxikusnak bizonyult. Leglényegesebb azonban az a tény, hogy az A2780 emberi petefészekkarcinóma A2780/124 és A2780/DDP altörzsei - amelyek ciszplatinnal szemben rezisztensek - a (3) képletű vegyülettel szemben nem ellenállók, s ez látható abból, hogy az IC50 arányok legfeljebb 4,0 értéket vagy ennél kisebb értéket tesznek ki. A találmány szerinti vegyület hatása az L1210 egér-leukémiára Vizsgáltuk a platinakomplex daganatgátló hatását az L1210 egér-leukémiasejtekkel szemben. 20 g testtömegű CDF egereket intraperitoneálisan 106 L 1210 ascites leukémiasejttel oltottunk Az aktív platinakomplex adagolását a daganatsejtek intraperitoneális beültetése utáni napon kezdtük A komplexet intraperitoneális befecskendezéssel, különböző mennyiségekben adagoltuk Minden egyes dózisra 6 egérből álló csoportot alkalmaztunk, és az állatoknak a kezelés napján egyszeri dózist adagoltunk Kontrollcsoportként fiziológiás konyhasóoldattal kezelt egereket alkalmaztunk Pozitív kontrollként ciszplatinnal kezelt egerekből álló csoportot is beiktattunk Az egereket a kezelés előtt, majd az 5. vagy 6. napon mértük, és testtömegük átlagos változását tekintettük a toxicitás mértékének Naponta értékeltük az állatok mortalitását (elhullását), majd a kísérleteket 30 nap elmúltával fejeztük be. A daganatgátló hatást a T/C% alapján határoztuk meg: ez a kezelt csoport átlagos túlélési idejének a fiziológiás konyhasóoldattal kezelt kontrollcsoport átlagos túlélési idejéhez viszonyított aránya szorozva százzal. A fiziológiás konyhasóoldattal kezelt egerek átlagos túlélési ideje általában 7 napnak adódott. Egy vegyületet akkor tekintettünk aktívnak ha a T/C értéke legalább 125%-ot ért el. A ,3” táblázatban összegeztük a platinakomplexek daganatgátló hatását L1210 egér-leukémiasejtekkel szemben. Feltüntettük minden egyes dózis esetében a T/C% értékeket. A (3) képletű TNO-40 kód jelű vegyület az összes vizsgált dózisokban hatásosnak bizonyult, maximális T/C értéke 4 mg/kg dózisban 193%-nak adódott. A találmány szerinti vegyület hatása a B16 melanómára Kiértékeltük a találmány szerinti TNO-40 kódjelű vegyület daganatgátló hatását B16 melanómasejtekkel szemben. Csoportonként 10 BDF egeret intraperitoneálisan 0,5 ml 10 tömeg/térf.%-os, homogén B16 melanóma-szövetszuszpenzióval oltottunk A hatóanyag intraperitoneális adagolását a daganatsejtek beültetése utáni napon indítottuk és naponta összesen 9 napon át folytattuk A kontrollcsoportot fiziológiás konyhasóoldattal kezeltük Pozitív kontrollként valamennyi kísérletünkben ciszplatinnal kezelt állatcsoportot is beiktattunk Naponta értékeltük az egerek túlélését, és a kísérleteket 60 nap elmúltával fejeztük be. A hatóanyaggal kezelt egerek átlagos túlélési idejét a kontrollállatokéhoz viszonyítva (T/C%) tekintettük a daganatgátló hatás mértékének Egy vegyületet akkor tekintettünk hatásosnak ha T/C értéke legalább 125%-nak adódott E vizsgálataink eredményeit a „C” táblázatban összegeztük minden egyes dózis esetében feltüntettük a T/C% értékeit. A találmány szerinti hatóanyag 0,4,0,8 és 1,6 mg/kg dózis befecskendezése után hatásos, maximális T/C értéke 163% 0,8 mg/kg dózisban. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
