203237. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tetrahidrofolsav-származékok biológiailag aktív izomerjének előállítására frakcionált kristályosítással
1 HU 203 237 B 2 A találmány tárgya eljárás 5,10-metin-(6R)-tetrahidrofolsav [5,10-CH-(6R)-THF; ,,(6R)-I”], biológiailag aktív tetrahidrofolátok, különösen 5-formil-[5-CHO(6S)-THF] és 5-metü-(6S)-tetrahidrofolsav [5-Me(6S)-THF], valamint ezek sóinak, különösen a biológiaüag jól tűrt kalcium-, magnézium-, nátrium- és káliumsók előállítására. Az említett (6S)-tetrahidrofolátok [(6S)-5,6,7,8- tetrahidropteroil-L-glutamátok] a folsav megfelelően stabil természetes biológiailag aktív formái (folsavkofaktorok). Az 5-CHO-(6S)-THF a citrovorum-faktor (azaz növekedési faktor a Leuconostoc citrovorum számára). A szervezetben az 5-CHO-(6S)-THF az 5,10-metilén-(6R)-THF-on keresztül 5-Me-(6S)-THF-vá alakul át. A tetrahidrofolátok két aszimmetriacentrumot tartalmaznak. A folsavból [N-(pteroil)-L-glutaminsavból] kiinduló szintézisüknél a glutaminsav-részben található királis szénatom L-formában van, míg a pteroil-rész 5,6-pozíciójában lévő kettőskötés hidrogénezésével kialakuló, 6-os pozícióban lévő királis szénatom [C(6)] a racém, (6RS) formában. A szintetikus tetrahidrofolátok ezért mindig a két diasztereomer 1:1 arányú keverékéből állnak. Természetes előfordulásuknál, például a májban, csak az egyik diasztereomer formában találjuk meg a tetrahidrofolátokat, amikor is az 5-CHO-THF mint 5- CHO-(6S)-THF, az 4-Me-THF mint 5-Me-(6S)-THF szerepel. A természetes tetrahidrofolsav C(6) szénatomjának abszolút konfigurációját J. C. Fontecilla-Camps és mtsai [J. Amer. chem. Soc. 101, (20) 6114/5 (1979)] szerint a szekvencia-szabálynak megfelelően S-sel kell specifikálnunk, a természetes 5,10-metilén-tetrahidrofolsav és az 5,10-metin-tetrahidrofolsav C(6) szénatomjáét pedig R-rel [R. Kalbermatten et al., Helv. Chim. Acta 64, (8) 2627 (1981), 4. lábjegyzet]. Az 5-CHO-(6RS)-THF-at (folinsav) kalciumsója formájában (Leucovorin) gyógyszerként használják a megaloblasztos folsavhiányos vérszegénység kezelésére, ellenméregként, a rákterápiában alkalmazott folsav-antagonisták, nevezetesen az aminopterin, a metotrexát és a fluorouracil elleni tűrőképesség erősítésére és az autoimmun megbetegedések, mint a psoriasis és a reumás arthritis kezelésére, valamint egyes, a kemoterápiában használatos parazitaellenes gyógyszerek, mint például a Trimethoprim-Sulfamethoxazol elleni tűrőképesség javítására. A kalcium-5-metü-(6RS)-tetrahidrofolátot hason-Az 5-CHO-(6RS)-THF szervezetbe való bejutása után a diasztereomer-keverék (6S)-része gyorsan átalakul 5-Me-(6S)-THF-vá, míg a (6R)-rész nem metabolizálódik [lásd J. A. Straw et al., Canser Research 44,3114-3119(1984)]. Az 5-CHO-(6R)-THF ezen felül gátol néhány, aC,_ transzferért felelős enzimet és ezzel a tetrahidrofolátok hatását [lásd R. P. Leary et al., Biochem. Biophys. Rés. Commun. 56, 484 (1973); V. F. Scott et al, id. folyóirat 14, 523 (1964); G. K. Smith et al., Biochemistry, 20, 4034 (1981)]. A (6S)-tetrahidrofolátok használata a (6RS)-tetrahidrofolátok helyett ezért terápiás előnyökkel is rendelkezne. Fennáll ezért az igény, hogy a diasztereomerek eddigi keverékét, amely a (6S)- és a (6R)-formát egyaránt tartalmazza, a természetes (6S)-formával váltsuk fel. Több erőfeszítés történt már a (6RS)-tetrahidrofolátsavak szétválasztására, az aszimmetrikus szintézisre és a fiziológiaüag aktív forma elkülönítésére. D. Cosulich és munkatársai [J. Amer. Chem. Soc. 74, 4215- 16 (1952), 2 688 018. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (1954. 08. 31.)] például megpróbálták az elválasztást az 5-CHO-(6RS)-THF egy alkáliföldfém-sójának, például kalcium- vagy stroncium-sónak vizes oldatából történő frakcionált kristályosítással megvalósítani [lásd még: J. C. Fontecilla-Camps et al., J. Amer. Chem. Soc. 101, 6114 (1979], A D. Cosulich és munkatársai által közzétett feltételek között az elválasztást nem lehet véghezvinni. Az 5-CHO-(6RS)-THF kalciurasójának vízből, 7-8-as pH-n történő kristályosítása során például mindig a (6RS)-formát kapjuk, amint az a királis HPLC-oszlopon végzett kromatográfiás analízissel és az optikai forgatóképesség vizsgálatával kvantitatívan igazolható. Nincs jelentősége, hogy nyers vagy tiszta kalcium- 5-formü-(6RS)-tetrahidrofolátot használunk, ugyanúgy mindig a (6RS)-formát kapjuk vissza. A (6S)-forma elválasztását és feldúsítását akkor sem sikerül elérni, ha az 5-CHO-(6RS)-THF egy alkáliföldfém-sójának túltelített oldatát teljesen homogén 5-CHO-(6S)THF alkáliföldfém-sójával oltjuk be. A diasztereomer-pár elválasztását már kromatográfiás módszerekkel is megpróbálták [J. Feeney et al.. Biochemistry 20, 1837 (1981)]. Ezenkívül a (6S)-izomert előállították a dihidrofolátoknak dihidrofolátreduktáz jelenlétében történő redukciójával is [L. Rees etal., Tetrahedron 42, 117(1986)]. L. Rees és munkatársai (J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1987,470 és A2-0 255 042. számú európai szabadalmi leírás) leírtak egy elválasztási eljárást a (6RS)-THF-ra, amelynek segítségével az 5-CHO-(6S)THF és az 5-CHO-(6R)-THF kis mennyiségben előállítható. Az eljárás lényege az, hogy a (6RS)-THF-at például (-) klórhangyasav-metil-észterrel az 5-(-)mentiloxikarbonil-tetrahidrofolsawá alakítjuk át, ezt ismételt n-butanolos kezeléssel elválasztjuk, a kapott diasztereomereket hidrogén-bromid hangyasav és ecetsav keverékében kapott telített oldatával felmelegítjük, amikor is a hidrolízis után 5-formü-(6S)- és (6R)-THF keletkezik, és ezeket végül kalciumsó formájában izoláljuk. Ez az eljárás körülményes és nehéz, és a királis reagens előállításához erősen mérgező foszgén szükséges. Ezenkívül a kiindulási anyag, a (6RS)-THF nagyon bomlékony. A királis segédcsoportnak ecetsavban, 50°C-on HBr-dal történő lehasítása közben a gluta-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
