203205. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szterin liposzómák előállítására
1 HU 203 205 B 2 magglutinációs vizsgálatot 96 U-alakú mikrotartályt tartalmazó lemezen végezzük, sorozatban hígítva a liposzóma-szuszpenziókat 50 pJ foszfáttal puff erőit sóoldatban, majd mindegyik tartályba 40 pl, 0,5% vörös vérsejtet tartalmazó foszfáttal pufferolt sóoldatot adunk. A keveréket 60 percig 4 °C-on állni hagyjuk, majd fordított tükörrel észleljük. A kontroll (vörös vérsejt CHS-liposzómák nélkül) nem mutat hemagglutinációt. Valamennyi CHS-ot tartalmazó minta agglutinálja (kicsapja) a vörös vérsejteket, azok kivételével, amelyek az előző kísérletben zavarosak voltak. Ez az eredmény azt mutatja, hogy a CHS-liposzómák úgy reagálnak a gentamicinnel, hogy viszonylag kevesebb liposzóma vesz részt a hemagglutinációban, összehasonlítva a csak CHS-ot tartalmazó kontroll szuszpenzióval. 5. példa: Koleszterin-hemiszukcinát-liposzómák in vivo beadása A következő fejezetek eljárásokat és készítményeket ismertetnek bioaktív szerek in vivo beadására, a találmány szerint koleszterin-hemiszukcinát-liposzómákat használva. Meghatározzuk a beépített bioaktív szer klinikai hatékonyságát és - ahol szükséges - nyomon kö\ etjük a szer eloszlását a kiválasztott szervekbe. 5.1 ízületi gyulladás kezelése koleszterin-hemiszukcinát-multilamelláris liposzómákba beépített indometacin alkalmazásával 2-2,5 kg tömegű, fehér hím New Zeeland nyulakat két hét intervallumban kétszer immunizálunk intradermálisan 1 ml (20 mg/ml) marha szérumalbuminnal (BSA) (Mües Laboratories, Elkhart, IN) komplett Freund-adjuvánsban emulgeálva. A harmadik héten a nyulak a jobb térdízületbe, ízületi gyulladás előidézése céljából egyetlen intraartikuláris injekcióban 1,0 ml sóoldatban 10 mg marha szérumalbumint kapnak. A bal térdízületek kontrollként szolgálnak. Az ízületek átmérőjét 0,01 mm érzékenységű Fowler-féle tárcsás kaliberkörzővel mérjük. A marha szérumalbuminnal injektált ízületek megdagadnak és tipikusan 3-4 mmrel vastagabbak mint a kontroll ízületek. A negyedik héten a nyulak ízületi gyulladás előidézésére egy másik intraartikuláris injekcióban marha szérumalbumint kapnak sóoldatban. A CHS-multüamelláris liposzómákat a 3.1 fejezet szerint állítjuk elő, 270,0 mg CHS-ot és 10 mg indometacint használva, így a végső koncentráció 1,0 mg/ml indometacin. A gyulladás előidézése után 3 nappal a marha szérumalbuminnal injektált állatok egyetlen intramuszkuláris injekcióban kapnak CHS-vesiculákba beépített 1 mg/ml indometacint (a teljes dózis 1 mg/ml állat). Az ízületi duzzadását még 10 napon át mérjük. Az 5. ábrán grafikusan ábrázolt eredmények azt mutatták, hogy a CHS-multilamelláris liposzómákba beépített indometacin intramuszkulárisan beadva hatásosan csökkenti az ízület duzzadtságát. 52 Koleszterin hemiszukcinát-kis unilamelláris liposzómákba beépített diazepam in vivo beadása Egereket intravénásán vagy intramuszkulárisan beoltottunk 500 pkg testtömeg a 3.2. fejezet szerint előállított CHS-kis unilamelláris liposzómákba beépített diazepammal. A diazepam az egerekre szedatív hatást gyakorol (az egerek az oltás után elalszanak) jelezve a beépített szer aktivitást csökkentő hatását. 5.2.1. Eloszlás a szervekben intravénás inoculálás után Beépített diazepamot tartalmazó CHS-kis unüamelláris liposzómákat készítünk a 3.2. fejezet szerint. A liposzómák ultrahanggal (bath sonicator) végzett kezelése után a szuszpenzió abszorpciója 550 nm-en mérve 0,370. Ezután a CHS-kis unüamelláris liposzómák szuszpenziójának 44,1 pl aliquot részét üveg kémcsőbe tesszük, amelyhez 40 pCi '4C- diazepamot (specifikus aktivitása 181 pCi/mg, 100 pCi/ml etanolos oldatba adagolva) adunk és nitrogénatmoszférában megszárítjuk. Az oldatot 5 pereit örvénylő keveréssel keverjük, majd 1,282 ml 0,01 M trisz-HCl (pH=7,3), 0,14 M NaCl puffert adunk hozzá, így a szuszpenziót harmincszorosára hígítjuk, ez egerek kezeléséhez 0,167 mg/ pl diazepam terápiás dózist ad. A14C-diazepamot tartalmazó CHS-kis unüameüáris liposzómák szuszpenziójának 0,1 ml aliquot részét 35 g tömegű öntudatnál lévő, koplaltatott Swiss- Webster egerek farokvénájába injektáljuk. A kontroll egereket nem beépített14C - diazepam ekvivalens dózisával oltjuk be. Az injekció után 1,2 vagy 5 órával az egereket nyakcsigolyájuk kimozdításával leöljük, és a belső szerveket (vese, tüdő, lép, máj, bél, agy, szív, hasnyálmirigy és zsír) eltávolítjuk és egy vérmintát veszünk A szerveket megmérjük, és egy kis mintát (20- 40 pg) mindegyikből Mahim és Kohberg eljárása szerint [Analytical Biochem. 16, 500 (1966)] digerálunk és színtelenítünk. Ezután a mintákat 5 napig sötétben tartjuk hogy a kemüumineszencia megszűnjék, mielőtt a radioaktivitást megmérnénk. A kísérlet eredményeit a 6. ábra szemlélteti. A CHS-kis unüamelláris liposzómákba beépített diazepammal beoltott egerekben a szer nem halmozódik fel a lépben, jelezve, hogy a CHS-kis unüamelláris liposzómákba beépült diazepam intravénásán in vivo beadva, nem úgy viselkedik, mint a foszfolipid-liposzómákba beépített szer. 5.3. Koleszterin-hemiszukcinát-mul tilamell áris liposzómákba beépített króm in vivo beadása Abból a célból, hogy megáüapítsuk, vajon a CHS- liposzómák érintetlenek maradnak-e, ha ezeket in vivo beadjuk, egereknek beadott intravénás injekció után meghatározzuk a szabad vizes jelzett anyag eloszlását a szervekben, összehasonlítva a CHS-liposzómákba beépített jelzett anyag eloszlásával. Végül összehasonlítjuk a nem beépült 51króm (51Cr), a CHS-multüamelláris liposzómákba beépült 51króm és foszfolipid-vesiculákba beépült 51króm eloszlását 6 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 18
