203205. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szterin liposzómák előállítására
1 HU 203 205 B 2 a szervekben. A kísérleteket az alábbi előírások szerint végezzük: a.) Nem épült 51 Cr Az 51Cr-ot mint 51CrO2“-0t alkalmazzuk steril 0,9%-os sóoldatban (New England Nuclear, Newton, MA). A szabad 51 Gr-injekciót úgy készítjük, hogy az 51Cr 0,9%-os sóoldatának 100 pl-ét 0,01 M trisz-HG (pH-7,3), 0,14 M NaQ, 5% dextróz pufferral 1,5 ml tdjes térfogatra hígítjuk. Ebből 16 darab 40 g tömegű hím Swiss Webster egérnek a farokvénájába intravénásán beadunk 0,1 ml-t (körülbelül 700 000 beütés/perc). b) 51Cr CHS-multilamelláris vesiculákban Egy úgy állítjuk elő, hogy száraz CHS-trisz só port nyomnyi mennyiségű 51Cr-ot (51Cr2-steril 0,9%-os sóoldatban) tartalmazó 0,01 M'trisz-HG (pH=7,3), 0,14 M NaCl, 5%-dextróz pufferban feloldunk. Az elegyet erélyes keveréssel keverjük és azonnal ultrahangkezelésnek vetjük alá 30 percig. Centrifugálással a terméket kis gömbökké alakítjuk, az előzőekben leírt módon háromszor mossuk, a végső gömböcskéket 10 mg CHS/ml végső koncentrációra újra szuszpendáljuk és fényszórási analízissel (Nicomp quasielastic light scattering analysis) átmérőjüket 1 mikronban állapítjuk meg. Ebből 12 darab, 40 g tömegű hím Swiss Webster egérnek a farokvénájába intravénásán beadunk 0,1 ml-t (körülbelül 120 000 beütés/perc). c) 51CV EPC-kis plurilamelláris liposzómákban Ezt úgy állítjuk elő, ahogyan azt az ezzel összefüggésben lévő 476 4% sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli bejelentésünkben Lenk és munkatársai „Stable PlurilameUar Vesicles, Their Preparation and Use” cím alatt leírták, amit hivatkozással ide beépítünk. Ezután 5 ml-es tételeket készítünk úgy, hogy 65 mg tojás foszfatidü-kdint (EPQ kloroformban fdoldunk és megszárítjuk úgy, hogy az EPC filmet képez A filmet 10 ml éterben újra szuszpendáljuk és a szuszpenzióhoz az 51 Cr02 = 0,9%-os sóoldatának (pH=8) 0,3 ml-ét adjuk A keveréket ultrahanggal emulgeáljuk miközben az étert nitrogénatmoszférában egyidejűleg elpárologtatjuk. Az így kapott stabil plurilamelláris liposzómákat 5 ml 0,01 M trisz-HQ (pH-7,3), 0,14 M NaG, 5% dextróz pufferban újra szuszpendáljuk és centrifugálással gömböcskékké alakítjuk A gömböket a be nem épült5 ‘króm eltávolítása céljából háromszor mossuk, és a végső terméket 5 ml 0,01 M trisz-HG (pH=7,3), 0,14 M NaG, 5% dextróz pufferban újra szuszpendáljuk Az EPC végső koncentrációja 13 mg/mL Ebből 12 darab 40 g tömegű hím Swiss Webster egérnek a farokvénájába intravénásán 0,1 ml-t beadunk (körülbelül 100 000 beütés/perc). 1,2,5 és 24 óra múlva minden csoportból 3 egeret, amelyet egy liposzóma készítménnyel kezeltünk és 4 egeret abból a csoportból, amelyet be nem épített 5'krómmal kezeltünk, nyakcsigolyájuk kimozdításával leölünk. Az állatok szerveit kivesszük, 0,9%-os sóoldattal leöblítjük és az előzetesen leírt módon számlálva megállapítjuk a vizsgált szervekben maradó dózis%-ot és a dózis%/gramm értéket. Az eredményeket a 7. ábrák szemléltetik Ezek azt mutatják hogy a be nem épített króm (7C ábra) gyorsan kiválasztódik és nem koncentrálódik egyik vizsgált szervben sem. A CHS- és EPC-vesiculákba beépült króm 24 órával az injekció után is mérhető szinteken marad, jelezve, hogy a CHS-vesiculák, valamint az EPC-kis plurilamelláris vesiculák in vivo érintetlenek maradnak. Az EPC-kis plurilamelláris vesiculák (13 mgúnl), amelyek közepes átmérője 0,5-1,0 mikron, felgyülemlenek a májban, tüdőben és lépben (7B ábra), vagyis a liposzóma-eloszlás tipikus sémája szerint Az ekvimdáris CHS-vesiculák elsősorban a májban gyülemlenek fd, és sokkal kisebb mértékben a tüdőben és lépben (7A ábra). Ezek az eredmények mutatják az eltérést a két liposzóma-készítmény in vivo doszlási sémájában. 5.4.Koleszterin-hemiszukcinát-multilamelIáris liposzómákba beépített humán növekedési hormon in vivo beadása 125humán növekedési hormont (HGH, New England Nuclear, Boston, MA) tartalmazó CHS-multilamelláris liposzómákat állítunk elő a következőképpen: CHS-trisz-sót adunk 0,01M trisz-HG, 0,14 NaG pufferhoz (pH=7,4), amely 1 pCi/ml l25I-humán növekedési hormont (New England Nuclear, Boston, MA) tartalmaz, így a CHS-trisz só végső koncentrációja 25 mg/ml. A szuszpenziót üveggyöngyökkel erélyes keveréssel keverjük. Összehasonlítva a kiindulási anyag radioaktiv számlálásával, az így kapott CHS-multilamelláris liposzómák 10% 125I-hurnán növekedési hormont építettek be. 12 nőstény Swiss Webster egérből álló csoportnak a hátsó lábába intramuszkuláris injekcióban beadunk 0,5 ml,125I-humánnövekedési hormont beépítve tartalmazó CHS-multüamelláris liposzóma szuszpenziót. 12 egérből álló kontroli-csoportot 0,5 ml, szabad 125I-humán növekedési hormont tartalmazó, 0,01M trisz-HG, 0,14 M, NaG pufferral injekciózunk. Mindkét csoportban mindegyik állat körülbelül 35 000 beütés/perc radioaktivitást kapott Az injekció után periodikus időközökben az egereket leöljük, hátsó lábukat boncoljuk és a visszamaradó összes radioaktivitás %-os mennyiségét meghatározzuk. Az V. táblázat adatai azt mutatják, hogy jelentősen több 125I-jelzett humán növekedési hormon marad vissza, ha CHS-multilamelláris liposzómába van beépítve. Ha tehát intramuszkulárisan injektáljuk, a CHS-liposzómákba beépült szer hosszan tartó, késleltetett módon szabadul fel V táblázat A beadott l25I-humán növekedési hormon késleltetése multilamelláris liposzómába beépítve Oltóanyag A lábban maradó radioaktivitás % (N=12 állat) idő(óra) 3 24 72 168 Kontroll3) 125i-hgh 125i-hgh 5 0,7 0,2 0,3 CHS-vesicu lákbanb) 56 37 29 22 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 19
