203205. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szterin liposzómák előállítására
1 HU 203 205 B 2 pos vizsgálata azt mutatja, hogy a kettős rétegek keresztmetszeti vastagsága különböző. Ez arra utal, hogy az indometacin valóban a kettős rétegek lipid részében van elosztva, oly módon, hogy úgy látszik azt megvastagítja és nagyon nem-egyenletes konfigurációt ad ennek; vagyis a vastagság változik, amikor egy kettős réteget a metszésvonalán végigvizsgálunk. Ez a hatás valószínűleg speciális azokra a szerekre, amelyek oldhatósága olyan, hogy a kettős rétegek lipid részébe épülnek be. 3.2. Diazepam beépítése koleszterin-hemiszukcinát-kis unilamelláris liposzómákba A diazepam egy szedatív vagy nyugtatószer (vagyis valium), oldódik kloroformban,- dimetil-formamidban, benzolban, acetonban és alkoholban, de vízben csak kevéssé oldható. Diazepamot beépítve tartalmazó CHS-kis unüamelláris liposzómákat állítunk elő a következőképpen: 2,3,4 vagy 5 mg diazepamot adunk 5 pl 3H-diazepamot (76,7 Ci/mmól, New England Nuclear, Boston, MA) tartalmazó kémcsőbe. Mindegyik kémcsőbe elegendő metanolt öntünk ahhoz, hogy a szer feloldódjék (maximum 2 ml metanol). A keveréket ezután rotációs bepárlásnak vetjük alá, így vékony filmet képezünk, amit a metanol teljes eltávolítása céljából éjszakán át vákuumban szárítunk A megszárított fűmet ultrahanggal kezelt CHS-kis unilamelláris vesiculák (előállítva az alábbiak szerint, 50,100 vagy 200 mg/ml CHS- tal) 1 ml szuszpenziójában újra szuszpendáljuk, üveggyöngyök alkalmazásával örvénylő keveréssel keverjük és Millipore szűrőn (0,22 pm, Millipore Corp., New York, NY) szűrjük A CHS-kis unilamelláris liposzómákat a következő előírás szerint állítjuk elő: 50,100 vagy 200 mg CHS- trisz sót 1,0 ml 0,01 trisz-HCl (pH=7,3), 0,14 M NaCl puffernd örvénylő keveréssel keverünk. A keveréket ultrahanggal (probe sonicator) kezeljük körülbelül 0,40 optikai sűrűségig, amit 550 nm-en mérünk (vagyis „tiszta” oldatig), majd centrigufáljuk (1000 x g), így eltávolítva a titánt, ami esetleg az ultrahang-szonda hegyéről került a keverékbe. A CHS-kis unüamelláris liposzómák szuszpenzióját ezután a kémcsőből dekan táljuk. Az ultrahanggal kezelt CHS-kis unilamelláris liposzómák által beépíthető diazepam relatív mennyiségét a minták standard készítménnyel való összehasonlításával határozzuk meg. A standard készítményt ugyanolyan módon állítjuk elő, mint a mintákat, azzal az eltéréssel, hogy csak radiojelzett diazepamot adunk hozzá (vagyis a 2-5 mg diazepamot kihagyjuk a CHS- kis unilamelláris liposzómák standard készítményéből). Minden esetben a szűrt szuszpenziók 10 pl aliquot részének radioaktivitását számláljuk 10 piszcintillációs folyadékban. Az eredményeket a IV. táblázat szemlélteti. TV. táblázat Diazepam beépítése ultrahanggal kezelt CHS-kis unilamelláris liposzómákba Diazepam koncentráció (mg/ml) A beépült 3H-diazepam, % CHS-koncentráció (mg/ml) 50 100 100 2 86 100 100 3 79 95 89 4 58 100 100 5 53 100 100 Az eredmények azt mutatják, hogy a 100 és 200 mg/ml koncentrációjú CHS a legnagyobb koncentrációban (5 mg/ml) alkalmazott diazepam 100%-át beépíti. Mivel mind a 100, mind a 200 mg/ml koncentrációjú CHS elegendő diazepamot épít be, a 100 mg/ml a CHS ideális koncentrációja diazepam beépítéséhez. 4. példa: Koleszterin-hemiszukcinát-liposzómák alkalmazása aminoglikozid-koncentráció meghatározására szérumban Megfigyeltük, hogy a CHS-liposzómák viszonylag kis koncentrációja (1 pg/ml CHS alatt) erősen agglutinálja a vörös vérsejteket (RBC) foszfáttal puff erőit sóoldattal (PBS) készült szuszpenziójából. Mivel a CHS vesiculákat a Ca++ és más kationok, így az aminoglikozid-antibiotikumok is kicsapják, a CHS-liposzómák használhatók aminoglikozid-antibiotikumok koncentrációjának meghatározására szérumokban, a következőképpen: a) meghatározzuk az antibiotikumot tartalmazó szérumnak azt a hígítását, amelynél egy fix mennyiségű CHS-liposzóma kicsapódik; és b) hemagglutinációs titrálással meghatározzuk az antibiotikumot tartalmazó szérum hozzáadása után megmaradó ki nem csapott szabad liposzómák koncentrációját. Az antibiotikum pontos mennyiségét mindkét esetben meghatározhatjuk úgy, hogy összehasonlítást végzünk az antibiotikum ismert koncentrációiból származó standard görbével. Az alapvető kísérleteket az alábbiakban ismertetjük: Foszfáttal puff erőit sóoldatban oldott 25 pl gentamicin-szulfátot (1 mg/ml) sorozatban hígítunk szérumban (vagyis a szérum 25 pl aliquot részeiben). Ezután mindegyik mintához hozzáadunk 24 pl aliquot CHS-kis unilamelláris liposzómát, amit úgy készítünk, hogy CHS-trisz sót 25 mg/ml koncentrációban 0,01 M trisz-HCl (pH«7,3), 0,14 M NaCl pufferban ultrahanggal kezelünk A keveréket körülbelül 10 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd az egyes keverékek zavarosságát megállapítjuk. Csak az 50 pg vagy ennél több gentamicint tartalmazó keverékek mutatnak látható csapadékot, jelezve, hogy a CHS-liposzómák reagáltak a gentamicinre. Ezután a kicsapott anyagot gömböcskékké alakítjuk, és a felülúszót használjuk a csirke vörös vérsejtjeivel hemagglutinált CHS-kis unilamelláris liposzómák koncentrációjának a meghatározására. A he-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 17
