203205. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szterin liposzómák előállítására
1 HU 203 205 B 2 vidszénláncú alkoholokban, észterekben és ketonokban, klórozott szénhidrogénekben, benzolban és éterben. Kis unilamelláris liposzómákat készítünk a következőképpen: 100 mg tilozin-bázist (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN) és 200 mg CHS-trisz sót 4 ml foszfáttal pufferolt sóoldatban (pH=7,4) örvénylő keveréssel keverünk. A CHS-multilamelláris liposzómák így kapott tejszerű szuszpenzióját 15 percig ultrahanggal kezeljük (probe tip sonicator). (Elővigyázatossági intézkedésképpen a kémcső köré jégfürdőt teszünk, hogy a keverék hőmérsékletét alacsonyan tartsuk.) Ezután a keveréket még 1 óra 45 percig ultrahanggal kezeljük (bath sonicator). Két óra ultrahanggal végzett kezelés után a CHS-kis unilamelláris liposzómákba beépült tüozint a szuszpenziótól elkülönítjük úgy, hogy a szuszpenziót 10 percig centrifugáljuk (10 000 x g), így kis gömböket és opalizáló felülúszót képezve. Az ultrahanggal kezelt CHS-kis unüamelláris liposzómákat a felülúszóban vizuálisan összehasonlítjuk egy olyan szuszpenzióval, amit úgy készítünk, hogy 100 mg tüozin-bázist (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN) adunk azonos térfogatú vízhez. A tilozin-bázis szuszpenziójában csapadék képződik, de nem képződik csapadék a tüozint tartalmazó CHS-kis unüamelláris liposzómák készítményében. A tüozin tehát legalább 48 órára beépülve maradt. 3. példa: Koleszterin-hemiszukcinát-liposzómák alkalmazása lipid-oldható vegyületek beépítésére A lipid-oldható bioaktív szerek beépítését az indometacin és a diazepam példáján mutatjuk be. 3.1.1 Indometacin beépítése koleszterin-hemiszukcinát-multilamelláris liposzómákba Az indometacin, egy prosztaglandin inhibitor, vízben gyakorlatüag oldhatatlan. Az indometacin szabad sava oldódik etanolban, éterben, acetonban és ricinusolajban. Bioaktív szerként az indometacin különböző mennyiségeit beépítve tartalmazó CHS-multüamelláris-liposzómákat a következőképpen állítunk elő: 25 mg CHS-trisz sót 1-5 mg indometacint és 10 pl 14C-indometacint (22,0 mCi/mmól, New England Nuclear, Boston, MA) gömblombikban összekeverünk. A keverékhez annyi metanolt adunk, hogy elegendő legyen valamennyi komponens feloldásához. Ezután a keveréket rotációs bepárlóban bepároljuk, az edényen vékony filmet képezve, és az összes metanol biztos eltávolítása céljából éjszakán át vákuumban szárítjuk. Ezután CHS-multüamelláris liposzómákat képezünk, úgy, hogy a lombik tartalmához 1,0 ml 0,01 M trisz-HCl (pH=7,3), 0,14 M NaCl puffert adunk. A szuszpenziókat üveggyöngyökkel örvénylő keveréssel keverjük és 2 órán át nyugodtan állni hagyjuk. Két óra múlva a beépült indometacin relatív mennyiségét a CHS-multüamelláris liposzőmákban meghatározzuk a következőképpen: mindegyik mintához 9,0 ml 0,01 M trisz-HCl (pH=7,3), 0,14 M NaCl puffert adunk, és a keveréket 10-20 percig centrifugáljuk (10 000 x g). Az így kapott gömböcskéket háromszor mossuk 10 ml 0,01 Mtrisz-HO (pH=7,3),0,14MNaClpufferbanés 1,0 ml végső térfogatra 0,01 M trisz-HQ (pH=7,3), 0,14 M NaCl pufferban szuszpendáljuk. Készítünk egy standardot azonos módon mint a mintát, azzal az eltéréssel, hogy a kiindulási keverékhez csak radiojelzett indometacint adunk (vagyis az 1 -5 mg indometacint kihagyjuk a CHS- multüamelláris liposzómák standard készítményéből). Mindegyik minta szűrt 20 pl aliquot részének radioaktivitását 10 pl szcintülációs folyadékban számláljuk A standard és az indometacin különböző koncentrációt tartalmazó minták összehasonlítása lehetővé teszi a beépült indometacin százalékos mennyiségének a meghatározását. Az eredményeket a ül. táblázat szemlélteti 777. táblázat Indometacin beépítése CHS-nudtilamelláris liposzómákba Indometacin koncentráció (mg/ml) 14C-indometacin {%) beépülve a CHS-multüamelláris liposzómákba 1 78 2 70 3 37 4 28 5 34 Az eredmények azt mutatják, hogy az indometacin 78%-ig képes beépülni a CHS-multilamelláris liposzómákba. 3.1.2 Az indometacint tartalmazó koleszterin-hemiszukcinát-liposzómák ultrastruktúrája Abból a célból, hogy megáüapítsuk, hogy a beépült indometacin megváltoztatja-e a membrán-liposzómákat, az indometacin jelenlétében előállított CHS- multüamelláris liposzómákat (lásd 8.1.1. fejezet) a már ismertetett módon elektronmikroszkópiának alávetjük A fagyasztott metszetekkel végzett elektronmikroszkópiában kis nagyításoknál az „üres” CHS-multüamelláris liposzómák nem voltak megkülönböztethetők azoktól, amelyek indometacint tartalmaztak Vagyis, nem volt olyan nyüvánvaló jellegzetesség, ami csak az egyiknél vagy csak a másiknál észlelhető. Nagy nagyításnál azonban az indometacint tartalmazó CHS-multüamelláris liposzómák kettős rétegei megkülönböztethetők voltak. Mivel az indometacin vízben oldhatatlan szer és oldódik etanolban, éterben, acetonban és más nem-poláris oldószerekben, várható, hogy az indometacin lipidek jelenlétében olyan elrendezésben van jelen, hogy a víztől elkülönül. A kettős rétegek elektronmikroszkó-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 16
