203205. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szterin liposzómák előállítására
1 HU 203 205 B 2 de a CHS rendszer valójában növekedést mutat az ötvenedik szénatomtól a kilencvenedikig, jelezve, hogy a kettős réteg szerkezete fizikai és kémiai tekintetben teljes mértékben eltér az eddig ismertetett szerkezetektől. 1.8. A koleszterin-hemiszukcinát-Iiposzómák izotóniás duzzadása Az alábbi kísérletsorozatban összehasonlítjuk a koleszterin-hemiszukcinát- és a foszfolipid-multüamelláris liposzómák izotóniás duzzadási viselkedését. 1. CHS-multflamelláris liposzómákat készítünk, amint azt az 1.1. fejezetben leírtuk, 40 mg CHS-trisz sót alkalmazva, 2,0 ml 0,01 M trisz-HCl, 0,1 M KC1 pufferban. 2. EPC-multilamelláris liposzómákat készítünk, amint azt az 12.1. fejezetben leírtuk, 51,8 g EPC-t alkalmazva 2,0 ml 0,01 M trisz-HCl, 0,1 M KC1 pufferban. 3. EPC-bóI és a tojás foszfatidinsavból (EPA) álló lipid kettős réteget tartalmazó multilamelláris liposzómákat készítünk az 1.2.1. fejezetben a EPC-multilamelláris liposzómák előállítására ismertetett módszert használva, 41,1 mg EPC-t és 9,79 mg EPA-t alkalmazva 2,0 ml 0,01 M trisz-HCl, 0,1 M KC1 pufferban. Az így kapott EPCEPA-multüamelláris liposzómákban az EPCEPA mólarány 8:2. Örvénylő keverés után valamennyi multilamelláris liposzóma (vagyis a CHS-, EPC -és EPC£PA- multilamelláris liposzóma) szuszpenzióját a pufferban, amelyben előállítottuk, szobahőmérsékleten 2 órán át állni hagyjuk. Ezután mindegyik liposzóma-készítmény 20 pl aliquot részét 0,01 M trisz-HCl puffer 1,0 ml-es sorozatához adjuk, amelynek KCl-koncentrációja 0,055 M -0,5 M. Az elegyeket 1/2 órán át hagyjuk egyensúlyba jönni, és a fényszórást, a minták abszorpcióját 550 nm hullámhosszon mérve, meghatározzuk. Az eredmények grafikus ábrázolását a 4. ábra szemlélteti, amelyben az abszorpció van ábrázolva annak a közegnek a fordított arányú KCl-koncentrációjának függvényében, amelynek a liposzómákat kitettük. A növekvő abszorpció a lipid-liposzómák duzzadását jelzi. A B és D görbék azt mutatják, hogy - amint az várható volt - a foszfolipid-multilamelláris liposzómák) ideális ozmométerekként viselkednek A C görbe azonban azt mutatja, hogy bár a CHS multilamelláris liposzómák zárt szerkezetekként viselkednek, nemideális viselkedést mutatnak hipo- és hipertóniás közegekben. Viselkedésük - amint ezt a 4. ábra szemlélteti - teljes mértékben eltér attól, amit a koleszterinliposzómákban Brockerhoff és Ramsammy megfigyeltek [Biochim. Biophys. Acta. 691, 227-232 (1982)]. 2.1. példa: Kevéssé oldódó vegyületek beépítése koleszterinhemiszukcinát-liposzómákba A vízben kevéssé oldódó vegyületek beépítését CHS-liposzómákba a marha növekedési hormon, inzulin és tüozin példáján mutatjuk be. 2.1. Marha növekedési hormonok beépítése kolesztenn-hemiszukcinát-kis unilamelláris liposzómákba A marha növekedési hormon (BGH), amely egyetlen, körülbelül 191 aminosavat tartalmazó láncból álló egyszerű protein, részben oldódik vízben. A normál oldhatóság 8,0 pH-értéken 1-1,5 mg/ml. A BGH szerves oldószerekben, így kloroformban kicsapódik. CHS-multilamelláris liposzómákat készítünk, ahogyan azt az 1.2. fejezetben ismertettük, 25 mg CHS-trisz sót alkalmazva 1,0 ml 0,01 M trisz-HCl (pH=7,4), 0,14 M NaCl pufferban. A CHS-multilamelláris liposzóma készítményt ultrahanggal kezeljük, míg kitisztul, így ultrahanggal kezelt CHS-kis unilamelláris liposzómákat képezünk. Ezután 5, 10, 15, 25, 30 vagy 166 mg marha növekedési hormont (Ely Lilly and Co., Indianapolis, IN) adunk az ultrahanggal kezelt CHS-kis unüamelláris liposzómák szuszpenziójának aliquot részeihez. Az szuszpenziókat örvénylő keveréssel alaposan keverjük, így a protein részben eloszlik a CHS-kis unilamelláris liposzóma kettős rétegekbe. Az ultrahanggal kezelt CHS-kis unilamelláris liposzóma szuszpenziókat 1, 2 és 21 napig vizuálisan megfigyeljük, csapadék nem észlelhető, jelezve, hogy a marha növekedési hormon beépült a CHS-liposzómákba, valamennyi koncentrációban, amit 21 napig szobahőmérsékleten tartottunk megfigyelés alatt. 2.2. Inzulin beépítése koleszterin-hemiszukcinátkis unilamelláris liposzómákba A cink-inzulin, egy polipeptid hormon, bár könnyen oldódik hígított savban vagy lúgban, a vizes fázisban 4,5-7,0 pH-értéken gyakorlatüag oldhatatlan. Az inzulin-oldatok hajlama makroaggregátumok képzésére akadályozza a hosszú ideig inzulint szolgáltató rendszerek kifejlesztését. CHS-multilamelláris liposzómákat készítünk, ahogyan azt az 1.2. fejezetben leírtuk, 25 mg CHS-trisz sót alkalmazva, 1,0 ml 0,01 M trisz-HCl (pH=7,4), 0,14 NaCl pufferban. A CHS-multilamelláris liposzóma - készítményt ultrahangkezelésnek vetjük alá, míg kitisztul, így ultrahanggal kezelt CHS-kis unilamelláris liposzómákat képezünk, és a CHS-kis unüamelláris liposzómák szuszpenziójához max 47 mg cink-inzulin port (Boving Pancreatic Insulin, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) adunk. A szuszpenziót örvénylő keveréssel erélyesen keverjük, így az inzulin eloszlik a CHS-kis unüamelláris liposzóma kettős rétegekbe. Az ultrahanggal kezelt CHS-kis unilamelláris liposzómákat csapadék jelenlétére 1, 2 és 21 napig vizuálisan megfigyeljük. Csapadék nem volt észlelhető, ami jelzi, hogy az inzulin 5 mg/ml koncentrációba beépült legalább 21 napra szobahőmérsékleten. Az inzulin beépülése gyorsabban megy végbe 37 °C-on. 2.3. Tilozin beépítése koleszterin-hemiszukcinátkis unilamelláris liposzómákba A tüozin egy antibiotikum, amely vízben 25 6C-on 5 mg/ml koncentrációban oldódik, oldódik továbbá rö-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 15
