203205. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szterin liposzómák előállítására
1 HU 203 205 B 2 kicsinyek, átlagos átmérőjük 25 nm vagy ennél kevesebb. 1.6. A koleszterin-hemiszukcinát-liposzómák röntgendiffrakciós vizsgálata A különböző CHS-multilamelláris liposzóma készítmények röntgendiffrakciós vizsgálatát kétdimenziójú képerősítésű röntgensugár detektorral végezzük, amit más helyeken már ismertettek [Grüner, S. M. 1977, PhD thesis, Princeton University, Priceton NJ 09540 USA; Reynolds, Geo. T„ Milch, J. R. and Grüner, S. M„ Rév. Sei, Instr. 49,1241-1249 (1978); Tilcock, C. P. T., Bally, M. B., Farren, S. B., Cullis, P. R. and Grüner, S. M. Biochem., 23, 2696-2703 (1984)]. A röntgensugár ismétlődő térközeit: ± 0,5 Á-ben fejezzük ki. A CHS-diszperziókat 1,5 mm-es üveg röntgen-kapillárisokba helyezzük és epoxidugókkal lezárjuk. A mintákat gyengén vagy erélyesen hidratáljuk. Gyenge hidratáláshoz a puffert fecskendővel a röntgen-kapilláris aljában lévő száraz CHS-ra rétegezzük. A kapillárist ezután egy pillanatra egy asztali centrifugában (top centrifuga) centrifugáljuk, s így a lipid vizes pasztájából a levegőbuborékokat eltávolítjuk. Ezután a kapillárisokat lezárjuk és 5°C-on legalább 4 órán át hagyjuk egyensúlyba jönni. Az erélyes hidratálást úgy végezzük, hogy száraz CHS-ot puffernd és két üveggyönggyel kémcsőben összekeverünk. A keverék egy aliquot részét azután röntgen-kapillárisba átvisszük. A röntgendiffrakció azt mutatta, hogy a hidratált CHS multilamelláris szerkezetű. A 2(a) és 2(b) ábra kis szögű diffrakciót mutat, amely a 68,9 tömeg%, illetve 59,1 súly% CHS-ot tartalmazó gyengén hidratált mintákból származik. A diffrakciónak legfeljebb négy egyforma térközű elrendezése látható, ami megegyezik a 68,1 A, illetve 79,8 Á-nél ismétlődő multüamelláris elrendezéssel. Az elrendezés éles és határozott, jelezve, hogy a rács igen kevés rendellenességet tartalmaz. Ezek a koncentrált CHS-minták egyenletes pasztaszerű megjelenésűek, amelyekben pufferfelesleg nem látható, s ez megegyezik azzal a ténnyel, hogy az ismétlődő térköz növekszik, ha a víztartalom növekszik. Igen nagy vízkoncentrációknál a gyengén hidratált CHS-minták a hidratált lipid tetején vüágosan látható, feleslegben lévő pufferoldat tócsát mutatnak. Az üyen minták (összesen 20,2 tömeg% CHS) diffrakcióját a 2(c) ábra szemlélteti. A nagyobb szögű diffrakciós csúcsok kiszélesedése a rácsban jelentős rendellenességre utal. A rácsban lévő rendellenesség a rács pontos meghatározását megnehezíti, de ha réteges elrendezés van - mint a 2(c) ábrán - az ismétlődés körülbelül 86 A, ami nagy vizes terekre utal a lipid kettős rétegek között. Ha gyenge hidratálás alkalmazása helyett 20,7% CHS-ot tartalmazó mintát készítünk, úgy, hogy a száraz lipidet örvénylő keveréssel keverjük össze a pufferral, akkor a kapott minta egyenletes tejszerű megjelenésű. Amint azt a 2(d) ábra mutatja, a kis szögű diffrakció széles szóródási sávot mutat, ami nem utal élesen definiált rácsra. Hasonló diffrakciós jelleg volna várható egy multilamelláris rendszertől, amelyben a lamellák közötti vizes tér igen különböző. A híg CHS- diszperziók röntgendiffrakciója a leginkább arra utal, hogy az egy olyan multilamelláris rendszerből származik, amelyben a lamellák közötti erők gyengék. Más lipid-rendszereknél, így a híg tojás foszfatidil-kolin diszperzióknál a röntgendiffrakciós minták élesen definiált lamelláris rácsot mutatnak, amely főleg lipidből áll [Rand: Annu. Rév. Biophys. Bioeng. 10, 277-314 (1981)]. Ez a jól definiált rács-ismétlődés egy viszonylag éles minimum eredménye a rács-potenciálban, ami a lipidréteg elkülönülésének a függvénye. Ha a potenciál-távolság görbén csak egy csekély bemélyedés van, akkor gyenge interlamelláris erők és a rácsban jelentős rendellenesség várhatók. Úgy látszik, ez a helyzet a CHS-liposzómáknál. A 2(d) ábra mintájánál az ismétlődés körülbelül 86 Ä, míg a 2(a) ábrán az ismétlődés 68,1 A. Ez azt jelenti, hogy feleslegben lévő puffer jelenlétében a CHS-liposzómák víz : lipid aránya nagy. Hasonló eredményekre jutottak más, töltéssel rendelkező lipid-rendszereknél [Rand, lásd fent], 1.7. Koleszterin-hemiszukcinát-liposzómák elektron spin rezonancia analízise Tojás foszfatidlü-kolinból (EPC) készített multüamelláris liposzómákat (Avanti Polar Lipids, Birmingham, AL) spin jelzéssel láttunk el és ezeket összehasonlítjuk a hasonlóan jelzett, lényegüeg az előzőekben már ismertetett módon előállított CHS-trisz só-multilamelláris liposzómákkal. Az EPC-multüamelláris liposzómák esetében 1 mól% 5-, 7-, 9-, 10-, 12- vagy 16-doxü-sztearátot (Molecular Probes, Junction City, OR) adunk 40 mg lipidhez kloroformban, és az így kapott oldatot rotációs bepárlással megszárítva vékony filmet képezünk. Ezután 2 ml trisz-HCl puffert adunk hidratálás céljából a filmhez és addig keverjük, amíg a film teljesen szuszpendálódik. Az üy módon előállított EPC-multüamelláris liposzómákat kétszer mossuk a spektroszkópiás vizsgálat előtt. A CHS-multüameüáris liposzómák esetében a megfelelő spin-jelzett anyag 1 mól%-át etanolban a kémcső oldalán vékony fűmmé szárítjuk, miután ebbe 40 mg CHS-trisz só port és 2 ml trisz-HCl puffert tettünk. A szuszpenziót keverjük, és az így kapott liposzómákat kétszer mossuk. Valamennyi elektron spin rezonancia kísérletet IBM Instruments ER100D ESR spektrométeren végeztük. Az (S) paramétert ismert módon számítottuk ki [Griffith and Jist, Spin Labelling, Berliner, L. J. (ed.), Academic Press, N. Y. 1976]. A 3. ábra a CHS-multüameüáris liposzómák és az EPC-multüamelláris rendparaméter profüjait szemlélteti. A meghatározást úgy végezzük, hogy ezeket a készítményeket 5-, 6-, 7-, 9-, 10-, 12- vagy 16-doxüsztearáttal spin-jelezzük. Az EPC kettős rétegeknél a rendparaméter csökken, ha a szénatomszám a kettős rétegben nő, amint ezt az előzőekben már említettük. A CHS kettős rétegek szupramolekuláris szerkezete ettől lényegesen különbözik: nemcsak a kettős réteg feltűnően sokkal szüárdabb, mint az EPC kettős réteg, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 14
