203205. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szterin liposzómák előállítására
1 HU 203 205 B 2 Richmond, CA) visszük, amely 40 000-15 000 000 dalton molekulatömeg-tartományban működik, kiegyensúlyozzuk és kalibráljuk 0,01 M trisz-HCl (pH-7,3), 0,14 M NaCl pufferral. Ezután 1 ml-es frakciókat eluálunk az oszlopról, elkülönítjük ezeket és mindegyik frakció 10 pl aliquot részének radioaktivitását az előzőekben leírtak szerint meghatározzuk. A gélszűrésnél a szabad és a beépült inulin világosan elkülönül, s ez igazolja az inulin beépülését a CHS-kis unüamelláris liposzómákba. Ez az analízis azt mutatja, hogy az inulinnak körülbelül 1%-a épült be a CHS- kis unilamelláris liposzómákba. 1.4, Króm beépítése koleszterin-hemiszukcinátmultilamelláris liposzómákba 51 Krómot, mint beépített szert tartalmazó CHS- multilamelláris liposzómákat a következőképpen állítunk elő: 15,0,40,0,65,8,100,0,175,0,263,2,526,4vagy568,0 pjnól CHS-triszsót adunk 5ml 0,01 M trisz-HCl, 0,14 M NaCl (pH-7,3) pufferhoz, amely nyomnyi mennyiségű 51Krómot (New England Nuclear, Boston MA) tártálmazmaz és szobahőmérsékleten 2 órán át állni hagyjuk. A CHS-multflamelláris liposzómák így kapott szuszpenziója 51 krómot tartalmaz beépülv e. lAA.Króm beépülést hatásfoka koleszterin-hemiszukcinát-multilamelláris liposzómákba Abból a célból, hogy meghatározzuk az 1.4. fejezet szerint előállított CHS-multflamelláris liposzómák beépülési hatásfokát, mindegyik készítmény mintáit dializáló zacskókba (Thomas Scientific, Catalog No. 3787- D22, a molekulasúlyt 12 000 daltonnál választja el) pipettázzuk, amelyeket előzetesen desztillált vízben háromszor kifőztünk. A dializáló zacskókban lévő mintákat az elején gamma-számlálóban (TmAnalytic, model no. 1191) számláljuk. Ezután a mintákat 20 órán át azonos, 0,01 M trisz-HCl, 0,14 M NaCl (pH=7,3) puffá- ellenében dializáljuk, a visszatartott és dializált rész aránya nagyobb mint 1:150. Adializátumotazelsőóórában minden 2 órában cseréljük. A beépülés hatásfokát úgy határozzuk meg, hogy kiszámítjuk az eredetileg számlált érték visszatartott részét százalékban. Amint azt a II. táblázat szemlélteti, a beépülés hatásfokának a növekedése arányos a CHS-koncentráció növekedésével. II. táblázat Króm beépülési hatásfoka CHS-liposzómákba CHS-koncentráció (vmól) Beépült5'króm (%) 15,0 14,79 40,0 15,20 65,8 15,09 100,0 16,10 165,0 20,13 263,2 27,90 526,4 40,74 658,0 48,03 1.4.2. Beépült térfogat koleszterin-hemiszukcinát-multilamelláris liposzómákban: króm-beépülés és koleszterin-hemiszukcinát koncentráció Az 1.4.1. fejezet szerint előállított CHS-liposzómák beépült térfogatát a koleszterin-hemiszukcinát minden egyes koncentrációjára meghatározzuk, kiszámítva a bezárt oldott anyagot, a következő formulát használva: beépülés, % x kiindulási vizes térfogat [imól CHS Az 1. ábra adatai azt mutatják, hogy kevesebb króm/mól lipid épül be, mint ahogyan az CHS-trisz só koncentrációja nő. Ezért, bár a beépülés hatásfoka arányos a lipid koncentrációjának növekedésével, a beépült oldott anyag csökken, ahogy a lipid koncentrációja növekszik. A pontonkjént végzett kísérletek számát zárójben tüntetjük fel az egyes pontok mellet. 1.5. A koleszterin-hemiszukcinát-liposzómák ultrastruktúrája CHS-multflamelláris liposzómák és CHS-kis unilamelláris liposzómák mintáit készítjük el a CHS-trisz sót használva, ahogyan azt az 1.1. fejezetben leírtuk, csak inulin nélkül, fagyasztott metszetek elektronmikroszkópos vizsgálatához [a „freeze-etch” eljárást lásd: Pfenninger és munkatársai: J. Cell. Bioi. 65, 15-28 (1975)]. A CHS-multflamelláris liposzómák fagyasztott metszeteinek elektronmikroszkópos vizsgálata különálló egységeket mutat, amelyek legalább egy lamellával vannak összekötve, vagyis ezek liposzómák vagy lipid-vesiculák. A CHS-multflamelláris liposzómák méretükben igen heterogének, átmérőjók 800-10 000 nm között van. A nagyobb liposzómák több osztályba sorolhatók: egy vagy néhány külső lamellával és sok lamellával rendelkezők. A legtöbb nagyobb liposzómának jelentős, szemcsés jellegű, belső tere van, ami valószínűleg a vizes rekeszeltre utal. Számos esetben kis liposzómák vagy ezek csoportjai láthatók, többé vagy kevésbé szabadon a nagyobb liposzómák belsejében, néha négyöt réteg mélységben. Ez a szemmel látható „fészek" általában megfigyelhető a negatív töltésű foszfolipidekkel készített hagyományos liposzómáknál. Alkalomadtán szorosan egymás mellett elhelyezkedő lamellák zónái láthatók. Ezek minden tekintetben hasonlónak látszanak a hagyományos foszfdjipidmultilamelláris liposzómák lamelláihoz. Az ultrahanggal kezelt mintákat vizsgálva, ezek is sok kis gömböt tartalmaznak, amelyek mérete 50 nm- 500 nm. Ezek a vesiculák valószínűleg hasonlóak a foszfolipid-multilamelláris liposzómák ultrahang-kezelésével előállított kis unilamelláris liposzómákhoz. Mivel a kisebb CHS-liposzómák nem hasadnak, lehetetlen a belső szerkezetüket megállapítani vagy komponens lamelláikat egymástól megkülönböztetni. A CHS-liposzómákat 30 nm-es szűrőn tízszer átsajtolva, olyan liposzómákat kapunk, amelyek átlagos mérete körülbelül 65 nm. Ez ellentétben áll a French press eljárással készített liposzómákkal, amelyek igen 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 13
