203198. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immungátló, monokin-, különösen interleukin-1-gátló hatású gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 203 198 B 2 acetil-glükóz-aminidáz lizoziin-enzim aktivitását csonttenyészet-felülúszókban és koponyacsontok Triton 100 kivonataiban tenyésztés után Banerjee és Basu módszerével [Biochem.J.45,113 (1975)]. Az enzim aktivitásának változását a felezett koponyacsontra eső ^egységekben és a felszabadulás százalékos értékében fejeztük ki. E vizsgálatok során a találmány szerinti eljárásban alkalmazott vegyületek - különösen a lényegében tiszta Z-izomer alakú D2 és Hl jelű vegyületek - a kalcium felszabadulását gátolták, és ezzel párhuzamosan befolyásolták az N-acetil-glükóz-aminidáz enzimet 1 x 10-5 -5 X 10-6 M nagyságrendű koncentráció-tartományban. Meghatároztuk a lényegében tiszta Z-izomer alakjában lévő D2 jelű vegyület IC50-értékeit, és az alábbi eredményeket kaptuk: ic50 (M) Az alábbi Kalcium N-Acetüvegyület glükózjelenlétében amidináz pge2 2,2 x 10-5 7,9 xlO“6 LPS 2,8 x 10“3 * 5 8,3 x IO“6 1,25-Dihidro-D3-vitamin 3,8 x 10"5 3,7 xlO“5 (Az IC50-értékek kiszámítása céljából a kontrolltenyészetekben végbemenő felszívódás mértékének és a maximálisan stimulált tenyészetekben végbemenő felszívódásnak a különbségét 100%-nak vettük. Az lekérték a vizsgálandó anyagnak az a koncentrációja, amely a maximális felszívódást 50%-os mértékben gátolja. 3. A reumatoid (torzulással járó) izületi gyulladás állatmodelljén kifejtett módosító hatás vizsgálata 48 érett nőstény patkányon adjuváns artritiszt idéztünk elő, majd a vizsgálandó vegyületet 40 napig orálisan adagoltuk. A10., 20., 30. és 40. napon mértük az ízület duzzadását és a csontsűrűséget, és ezt placeboval kezelt kontrolláltatok paramétereivel hasonlítottuk össze. Ezenkívül megmértük a porc glikozamino-glikánjait (a következőkben: GAG) a combnyakízület fej-részében, amelyet a kezelési időszak után eltávolítottunk. A vizsgálat kezdetén, majd a 3., 6., 9., 16. és 22. napon meghatároztuk a szérum a2-makroglobulin-tartalmát. Amidőn a találmány szerinti eljárásban alkalmazható vegyületeket orálisan, naponta 2,5-20 mg/kg mennyiségben adagoltuk, a gyulladásos folyamat által kezdetben előidézett csontsűrűség-csökkenés után megfigyeltük, hogy a csont normális ásványanyag-tartalma helyreállt. Denzitometriás mérésekkel megállapítottuk, hogy nemcsak a csontsűrűség növekedett, hanem a szérum a2-makroglobulin-koncentrációi is a dózistól függően csökkentek. Az érintett porcok GAG-tartalmának elemzése azt mutatta, hogy a proteoglikán-tartalom a dózistól függő módon növekedett. A reumatoid ízületi gyulladás ezen vizsgálati modelljén a találmány szerinti eljárásban alkalmazható vegyületek - például a lényegében tiszta Z-alakú D2 jelű vegyület - a kóros állapotot módosító hatást mutatott, különösen 30-napos kezelés után; a találmány szerinti eljárásban alkalmazható vegyületek főként az adjuváns artritiszben szenvedő patkányok csontjára és porcára gyakoroltak védőhatást. A csontsűrűség in vivo mérésére érett patkányokon a radiográfiás-denzitometriás módszert alkalmaztuk [J. Amer.Ger.Soc. 17,142(1969)]. A vizsgálandó anyaggal végzett kezdés során a csontot hosszanti hányban vizsgáltuk, és megfigyeléseinket összehasonlítottuk egyrészt kezeletlen artritiszes patkányokon, másrészt kontroüállatokon végzett megfigyeléseinkkel. In vivo menynyiségi radiográfiás (pásztázó) módszert alkalmaztunk, aminek során paraméterként a trabekuláris tömeget vettük. A radiográfiás képet a letapogatás után viszonylagos optikai sűrűségi (ROD) egységekké alakítottuk át egy nagy feloldásé denzitometriás mérőműszerrel. A rendszer jdlemzői következtében (a sötétedés a viszonylagos optikai sűrűség növekvését jelenti) a regisztrált értékeket (l-x)-ben fejeztük ki, ahol x jelenti a viszonylagos optikai sűrűség kísérletesen mért értékét. így összhangba hoztuk a röntgensugarak csontszövetre kifejtett biológiai hatását (amely esetben a fűm sötétedése a csontsűrűség csökkenését jelzi). Az így kapott denzitometriás értékeket az állat testsúlyának függvényeként ábrázoltuk, aminek során azonos súlytartományon belüli állatcsoportokat választottunk. 4. Az immungátló (autoimmun betegségekre kifejtett) hatás vizsgálata Az alábbi kísérletekben a találmány szerinti eljábén tiszta Z-izomer alakjában levő D2 vagy Hl jelű vegyületet - orálisan, naponta 5-60 mg/kg mennyiségben adagoltuk önmagában vagy ciklosparin A-val kombinálva, amely utóbbit naponta, orálisan körülbelül 1-10 mg/kg mennyiségben, olívaolajos oldatban adagoltuk (tehát lényegesen kisebb dózisban, mint amit általában alkalmaztunk az immungátló hatás elérése céljából a leírt vizsgálati modelleken). 4.1 .Az uvea-gyulladásra (uveitis) kifejtett hatás: a kísérletileg előidézett autoimmun uveitis modulálása E vizsgálatot Nussenblatt és munkatársai általános módszerével [Arch. Ophthal. 100,1146 (1982)] végeztük. 6-10, egyenként 150-200 g testsúlyú nőstény Lewis-patkányt 30 pg szarvasmarha S-antigénnel immunizáltunk, amelyet 2,5 mg/ml Mycobacterium tuberculosis H 37 RA-val dúsított komplett Freund-adjuvánsban emulgeáltunk (1:1 tömegrész arányban). Az immunizálást az állat hátsó végtagjának talpába történő befecskendezéssel végeztük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7
